线粒体亚定位KillerRed增强宫颈癌HeLa细胞的辐射杀伤效应及机制

发布时间：2021-12-16 04:27

　　宫颈癌是全球女性癌症相关死亡的第二大原因,其发病率在过去几十年不断增加。虽然早期宫颈癌可以通过手术或放疗进行治疗,但晚期宫颈癌几乎是无法治愈的,需要新的治疗方法。放疗是宫颈癌的常规治疗手段,增强放疗的杀伤效应至关重要。线粒体是细胞中重要的细胞器,参与细胞各种活动,如能量产生、代谢、信号传导、细胞自噬与凋亡等多种活动,近年来线粒体和活性氧（ROS）作为癌症治疗靶点已成为热点。KillerRed（KR）是一种可遗传编码的二聚体红色荧光蛋白光敏剂,相对于化学光敏剂的主要优点是其在用适当基因转导可在肿瘤细胞中表达,并通过对靶细胞区室的精确损伤直接杀死细胞。在可见光照射下可产生大量ROS,利用ROS破坏癌细胞。本研究通过Pink1（PTEN induced putative kinase 1）的线粒体靶向序列（mitochondrial targeting sequence,MTS）介导KR亚定位于线粒体,进而可见光照射诱导ROS产生,从而增强电离辐射对宫颈癌的杀伤作用,并探讨其杀伤效应及分子机制。目的:研究Pink1线粒体靶向序列的线粒体亚定位功能,并以人宫颈癌HeLa细胞为对象,探讨可见光照... 

【文章来源】：吉林大学吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：88 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

Pink1-mtKR转染HeLa细胞后ROS的含量测定

Figure 3.1 Development of vectors for mtmCherry and mtKR.3.1.2 构建载体的线粒体亚定位功能鉴定Pink1 具有线粒体靶向序列，编码的蛋白能使该蛋白定位在线粒体外膜上，在本研究中利用这段序列与下游序列构建成融合表达载体也应该亚定位与线粒体上。因 KR 蛋白光照后丧失活性，所以不适于荧光显微镜观察，用氨基酸序列与其基本一致的红色荧光蛋白 mCherry 代替 KR 蛋白，进行线粒体亚定位鉴定。将 Pink1-mtmCherry 转染 COS-7 和 HeLa 细胞，并检测线粒体示踪蛋白 COXⅣ与mCherry 蛋白的表达，并用荧光显微镜观察结果并拍照（图 3.2）。线粒体标志分子 COXⅣ显示绿色荧光，定位于线粒体，mCherry 为红色荧光蛋白，结果显示，在两种不同细胞中，mCherry 与 COXⅣ均有共定位现象，证明重组质粒载体Pink1-mtmCherry 可以亚定位于线粒体，表明 Pink1-MTS 具有线粒体亚定位能力，可以将 KR 亚定位到线粒体上，为后续实验提供了保证。

× 200Figure 3.2 The mtmCherry co-localized the mitochondria with COX IV, × 200.3.2 ROS 含量检测为了研究所构建的重组质粒是否可以通过可见光照射诱导细胞产 ROS，将plxsp-flag（Empty vector）、plxsp-flag-Pink1-KillerRed（Pink1-mtKR）分别转染进HeLa 细胞中，利用 DCFH-DA 染色，检测平均荧光强度。由图 3.3 可见，光照前KR 蛋白为红色荧光，30 h 左右红色荧光值最大，其转染效率最高；而照射后红色荧光减少，暗示 KR 失活，同时 DCFH-DA 可将 HeLa 细胞染成绿色，而比未处理的 Hela 细胞（图 3.4 a 和 b）相比，表明用可见光照射 KR 会产生 ROS。


本文编号：3537481