基于质谱的常见呼吸道病原体高通量检测方法的建立与应用

发布时间：2022-02-13 08:31

　　呼吸道感染给人类造成了严重的疾病负担,特别是对于儿童的生命健康构成了极大的威胁。能够导致人类呼吸道感染的病原体种类繁多,超过80%的病例由病毒感染引起,而重症及死亡病例则主要归因于细菌的感染。准确掌握呼吸道感染的病原谱,可以为制订相关传染病的防控策略提供依据;临床上及早明确病原体,进行针对性的抗感染治疗则是控制感染的关键环节。目前常规使用的病原体鉴定方法:如病原体培养、血清学检测、免疫学检测等存在着耗费时间长、灵敏度低等缺点。以PCR技术为代表的分子检测方法灵敏快速,但大多无法兼顾病原体覆盖广度和样本检测通量这两个关键因素。同时,一些较为先进的检测技术却因昂贵的检测费用而难以广泛应用。鉴于此,本课题的目标是建立一种高效、廉价的呼吸道病原体检测方法。在本课题中,我们使用MassARRAY系统作为检测平台,利用多重PCR与MALDI-TOF质谱技术联用来鉴定目标病原体。通过对呼吸道病原体流行病学、检测方法的指南和文献进行综述,我们选择在呼吸道感染中常见、并且与疾病发生相关的病原体纳入检测范围。对于每一种目标病原体,选择种间特异且种内保守的基因作为检测靶基因。根据不同的病原体类别,其序列的收... 

【文章来源】：北京协和医学院北京市211工程院校985工程院校

【文章页数】：114 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

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图１３：人偏肺病毒Ａ、Ｂ亚型，人呼吸道合胞病毒Ａ、Ｂ亚型、人博卡病毒１型、??２型特异度评价结果。每个目标病原的一组质谱图中，上图为阴性样本的检测结果，??下图为阳性样本的检测结果。??４．３．２?ＲＶ－ＭＳ灵敏度的评价??我们将ＲＶ－ＭＳ的每一个检测靶基因克隆进入载体，根据定量结果进行稀释，??制备十倍质粒梯度，用ＲＶ－ＭＳ测试１拷贝每反应，至１００００拷贝每反应，五个浓??度梯度，每个梯度进行三次重复实验。对于ＲＶ－ＭＳ，在１００拷贝每反应浓度，所有??的目标病原体三次重复都能检测得到阳性结果，在１０拷贝每反应浓度，部分重复??实验可以观察到阳性结果。据此我们估计，ＲＶ－ＭＳ的检出限大约在１０－１００拷贝每??６８??

北京协和医学院中国医学科学院?博士学位论文??４．４．２?ＲＢ－ＭＳ灵敏度的评价??评价方法与实验流程同４．３．２节ＲＶ－ＭＳ灵敏度评价。评价的结果与ＲＶ－ＭＳ?—??致，ＲＢ－ＭＳ的检出限大约在１０－１００拷贝每反应之间。图１６是部分ＲＢ－ＭＳ灵敏度??评价的实验结果。??（Ａ）?Ｈｏｅｍｏｐｈｉｌｖｓ?ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ?（Ｂ）?Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ?ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ??２０ｔ?１?２０ｆ?＜．?－＞??


本文编号：3622863