人3型腺病毒LOOP1-6蛋白克隆表达及免疫鉴定

发布时间：2017-05-22 18:06

  本文关键词：人3型腺病毒LOOP1-6蛋白克隆表达及免疫鉴定，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)的实验技术筛选人流行性B属3型腺病毒典型性代表株,探讨其与GenBank的同源性。据检测结果挑选代表株,构建编码LOOP 1-6蛋白的质粒并在大肠杆菌BL21 (DE3)原核表达获得纯化的LOOP 1-6目的蛋白,以Weston-Blot法免疫鉴定。通过对其蛋白衣壳基因的变异变迁的探究和经构建重组质粒成功克隆表达及免疫鉴定LOOP 1-6目的蛋白,为临床的相应血清学诊断试剂盒的研发及腺病毒感染的防治提供实验指导。方法1.用北京卓诚惠生生物科技有限公司生产的ABT9+7呼吸道病毒多重PCR快速检测试剂,检测临床上呼吸道病毒感染的疑似病例的儿童咽拭子,进行病毒的初步筛查或者用欧蒙医学实验诊断股份公司的呼吸道病原谱抗体IgM检测试剂盒(间接免疫荧光法)检测患者血清抗体水平。2.根据腺病毒Hexon的LOOP 1-6或LOOP7的基因可定型血清,设计相应的引物,进行PCR及测序。由测序的结果,在NCBI上进行序列的Blast,判断腺病毒的型别。3.挑取3型的腺病毒,进行腺病毒的分离与增殖。增殖完成后,提取核酸。根据GenBank中3型腺病毒的Hexon、Penton base和Fiber的基因序列设计的相应的引物,进行PCR扩增和测序。4.用Sequencher 5.0对测序的结果进行处理,由软件MEGA5.0对处理后序列进行基因亲缘关系树分析、氨基酸和核苷酸同源性分析。5.选取3型腺病毒Hexon基因相对保守的毒株并设计引物,用于六棱体的LOOP 1-6的克隆PCR模板。克隆3型腺病毒Hexon基因的LOOP 1-6至载体pET-48b (+)质粒上,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导和镍离子亲和层析纯化,得到目的蛋白LOOP1-6。用抗6×His-tag抗体经Weston-Blot法免疫鉴定表达的蛋白。结果1.从陕西、湖南、河北、山东、云南、甘肃和吉林共七个省的送检标本中共检测出腺病毒阳性的229份,其中7型腺病毒121份；3型腺病毒35份；其他型别73份。2.在亲缘关系树中,可见七个省十二五期间的HAdV3的六棱体、五棱体和纤突与世界范围内的流行概况大体一致。只在湖南发现了两株Hexon基因的重组株,分别采自2012年和2013年。这两株毒株与日本2011年分离到P7H3+7F3(genbank:JN860679.1)的毒株的Hexon基因的核苷酸同源性达98.3%和98.4%,氨基酸同源性达99.6%和99.6%；Penton base基因的核苷酸同源性为99.2%、99.2%,氨基酸同源性为98.7%、98.7%；Fiber基因的核苷酸同源性为63.6%、63.6%,氨基酸同源性为57.1%、57.1%(如图8-a,b,c所示)。本实验室将其命名为P7H3+7F7,说明了HAdV3的六棱体基因有发生组内重组的可能性。除去这两株,其余毒株Fiber基因的核苷酸同源性在99.7%-100%间,氨基酸同源性为100%；Hexon基因的核苷酸同源性在99.9%-100%,氨基酸同源性为99.7%-100%间；Penton base基因的核苷酸同源性在98.8%-100%,氨基酸同源性为98.3%-100%,说明中国人HAdV3的基因很保守。3.经构建重组质粒成功克隆表达及免疫鉴定,获得纯化的LOOP 1-6目的蛋白。结论本研究采用多重PCR和血清间接免疫荧光法成功鉴别了腺病毒阳性感染的标本,标本三代扩毒成功后,经PCR测序等步骤初步阐明了中国七个省份十二五期间的3型腺病毒的蛋白衣壳基因比较保守的流行规律。经构建重组质粒成功克隆表达及免疫鉴定,获得纯化的LOOP 1-6目的蛋白,为后期的血清分型试剂盒的进一步的研究提供了前期的实验基础。
【关键词】：HAdV 3 间接免疫荧光 Hexon基因 Penton base基因 Fiber基因 蛋白表达 免疫鉴定 诊断试剂盒
【学位授予单位】：安徽理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R440
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-15
• 注释说明清单15-17
• 引言17-19
• 1 人3型腺病毒的基因特征19-44
• 1.1 材料19-23
• 1.1.1 标本来源19-21
• 1.1.2 主要试剂21-22
• 1.1.3 主要仪器22
• 1.1.4 主要耗材22-23
• 1.2 方法23-32
• 1.2.1 复苏、培养细胞23-24
• 1.2.2 冻存细胞24
• 1.2.3 病毒种类的初步鉴定24-28
• 1.2.4 人腺病毒荧光定量鉴定28-29
• 1.2.5 HEp-2细胞接种人腺病毒29-32
• 1.3 结果32-42
• 1.3.1 病毒种类的初步鉴定结果32-33
• 1.3.2 人腺病毒荧光定量PCR鉴定结果33-34
• 1.3.3 HEp-2细胞接种人腺病毒后的病变结果34-35
• 1.3.4 3型腺病毒Hexon、Penton base和Fiber基因的变异变迁规律的检测结果35-42
• 1.4 分析与讨论42-43
• 1.5 结论43-44
• 2 人3型腺病毒LOOP1-6蛋白克隆表达及免疫鉴定44-64
• 2.1 材料44-49
• 2.1.1 主要试剂44-45
• 2.1.2 主要仪器45
• 2.1.3 主要耗材45-46
• 2.1.4 主要试剂配方46-49
• 2.2 方法49-59
• 2.2.1 pGEM-T-HAdV3-Hexon-LOOP1-6质粒的构建49-53
• 2.2.2 pET-48b-HAdV 3-Hexon-LOOP1-6质粒的构建53-56
• 2.2.3 HAdV3-Hexon-LOOP 1-6蛋白的诱导表达及纯化56-59
• 2.3 结果59-62
• 2.3.1 pGEM-T-HAdV 3-Hexon-LOOP1-6质粒的构建59-60
• 2.3.2 pET-48b-HAdV 3-Hexon-LOOP1-6质粒的构建60-61
• 2.3.3 HAdV 3-Hexon-LOOP1-6蛋白的诱导表达及纯化61-62
• 2.4 讨论62-64
• 结论64-65
• 参考文献65-69
• 附录A pET-48b(+)质粒图谱69-70
• 附录B 重组质粒pGEM-T-HAdV3-Hexon-LOOP1-6测序图70-71
• 后记或致谢71-72
• 作者简介及读研期间主要科研成果72-73

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本文编号：386454