新德里金属-β-内酰胺酶的检测方法建立及应用

发布时间：2017-06-15 09:02

  本文关键词：新德里金属-β-内酰胺酶的检测方法建立及应用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：[目的]利用新德里金属-β-内酰胺酶(New Dehli Metallo-β-lactamase 1, NDM-1)的原核表达载体诱导表达NDM-1与6×His标签的融合蛋白,通过亲和层析法纯化NDM-1蛋白,采用体内培养法,能将稳定分泌抗NDM-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株3F8接种于BALB/c小鼠腹腔,制备鼠抗NDM-1单克隆抗体；以单克隆抗体和胶体金标记技术为基础,根据竞争抑制原理,建立NDM-1的斑点金免疫渗滤检测方法,并应用于细菌培养物中NDM-1的检测。[方法]1.采用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导携带NDM-1的原核表达载体的宿主菌表达NDM-1-6×His的融合蛋白,以SDS-PAGE电泳鉴定蛋白的分子量,将重组基因工程菌扩大培养并诱导表达,最后采用亲和层析法纯化诱导的目的蛋白,并研究它的酶促动力学特征。2.抗NDM-1单克隆抗体的制备与纯化采用体内培养法,将能够稳定分泌抗NDM-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株3F8接种于BALB/c小鼠腹腔,每只BALB/c小鼠接种106个杂交瘤细胞,共接种6只,获得含有抗体的腹水36m1。通过亲和层析法纯化,5 ml亲和层析柱,每次可获得4.50 mg高纯度的抗NDM-1单克隆抗体。采用ELISA法分析抗体免疫活性。3.胶体金及免疫金探针的制备采用柠檬酸三钠还原法,成功制备20 nm胶体金溶胶；此基础上建立抗NDM-1单克隆抗体的胶体金标记条件：最佳标记pH值为7.4,最佳标记量为8μg抗NDM-1单克隆抗体/ml胶体金。采用ELISA方法分析了免疫金探针活性。[结果]1.表达并纯化获得具酶活性的NDM-1-6×His融合蛋白,经酶促动力学实验证明纯化的融合蛋白具有较高的酶活性。2.NDM-1斑点金免疫渗滤检测方法的建立根据竞争抑制原理,以金标抗NDM-1单克隆抗体作为分析探针,NDM-1完全抗原NDM-1偶联物作为包被抗原,羊抗鼠IgG为质控点,初步建立了NDM-1的斑点金免疫渗滤检测体系(dot immunogold assay, DIGA)。当包被抗原浓度为6ng/ml,免疫金探针为原液时,肉眼判定NDM-1阳性,检测限为6ng/ml,检测时间为10 min左右.[结论]本研究获得了高效的重组基因工程大肠杆菌表达菌株,制备鼠抗NDM-1单克隆抗体；以单克隆抗体和胶体金标记技术为基础,根据竞争抑制原理,建立了NDM-1的斑点金免疫渗滤检测方法,并将其初步应用于细菌培养物中NDM-1的检测。
【关键词】：新德里金属-β-内酰胺酶1 原核表达 单克隆抗体 斑点金免疫
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R446
【目录】：

• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-10
• 符号说明10-11
• 前言11-14
• 一、研究背景11-13
• 二、研究目的13-14
• 材料与方法14-32
• 一、材料14-21
• 二、方法21-32
• 结果32-43
• 一、NDM-1蛋白的纯化及鉴定32-37
• 二、抗NDM-1单克隆抗体的制备及鉴定37
• 三、NDM-1斑点金免疫渗滤检测方法的建立37-43
• 讨论43-47
• 一、NDM-1蛋白的鉴定分析43
• 二、抗NDM-1单克隆抗体的制备及鉴定分析43-44
• 三、NDM-1斑点金免疫渗滤检测方法的应用分析44-47
• 小结47-48
• 创新与不足之处48-49
• 参考文献49-55
• 文献综述55-64
• 参考文献61-64
• 致谢64-65
• 攻读硕士学位期间发表的论文目录65-66
• 学位论文评阅及答辩情况表66

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