酸敏感性原酸酯键交联低分子量聚乙烯亚胺作为基因载体的制备及表征

发布时间：2017-06-23 18:16

  本文关键词：酸敏感性原酸酯键交联低分子量聚乙烯亚胺作为基因载体的制备及表征，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：基因治疗作为当今生物治疗的重要组成部分,已经成为医学领域里一个新的研究热点。与传统治疗方法相比,基因治疗从根源上修正了引起疾病的异常基因,并且能选择性地治疗多种严重威胁人类健康的疾病。然而安全、高效、靶向表达的基因载体是基因治疗成功的关键。在基因治疗的基础研究和临床应用中,经常使用的传递载体包括病毒载体(Viral vector)和非病毒载体(Non-viral vector)两类,其中,阳离子聚合物载体由于具有设计灵活、易于大规模生、低毒性、目的基因携带量大、基因尺寸不受限制且费用较低等优点,近年来受到研究者极大的关注。而在众多合成材料中,聚乙烯亚胺(Polyethylenimine, PEI)由于具备较高的电荷密度以及良好的质子缓冲能力已成为阳离子聚合物基因载体中的研究热点之一。其中,枝化PEI (25kDa)被称为高分子基因载体领域的“黄金标准”。尽管高分子量PEI转染效率较高,但因为其细胞毒性较大、不可生物降解等问题制约了PEI在临床治疗方面的应用。为了获得细胞毒性较低且转染性能优良的PEI载体,研究者们尝试了许多方法,近些年来,通过可降解键交联低分子量PEI获得性能优越的基因载体得到科学工作者们的持续关注。本论文通过一种简单、经济、高效的合成工艺制备了一种具有酸敏感性的丙烯酸类原酸酯单体(OEAc),之后通过控制投料比(1：1,1.75：1,3.5：1)与低分子量PEI (600 Da)发生迈克尔加成反应,合成了一系列主链含原酸酯的新型酸敏感型基因治疗载体(POEI 1、POEI 2、POEI 3)。并且采用多种实验方法对聚合物进行了表征并研究了它们的理化性质,核磁结果分析证明OEAc以及聚合物结构正确；凝胶渗透色谱(GPC)测定了聚合物数均分子量及分子量分布；通过测定聚合物伯胺含量证明了迈克尔加成反应的有效性,并且POEI 1的伯胺含量最高；酸碱滴定结果表明,POEI 1-3与25 kDa PEI相比具有更强的质子缓冲能力,且缓冲能力随着投料比的增加而增大,其中POEI 3的缓冲能力最强。原酸酯键具有高度酸敏感性,在酸性条件下能快速水解,因此聚合物主链酸响应性由1HNMR测定,结果显示POEI 1-3均具有较强的酸敏感性,三种聚合物主链原酸酯在pH=5.0环境下4小时内即完全降解,核磁分析其降解机制属于环外降解机制。在正常生理条件下,POEIs与质粒DNA通过静电作用相互结合,并有效压缩DNA形成复合物纳米粒子。通过琼脂糖凝胶电泳实验以及肝素置换实验评价聚合物DNA压缩及保护能力的强弱,结果表明,POEI 1-3均能有效压缩质粒DNA,并且DNA压缩能力与聚合反应投料比例有关,反应比例越大压缩能力越差,同时采用DNase Ⅰ降解实验进一步验证了POEI 1和POEI 2能够保护DNA免受DNase Ⅰ的酶解。动态光散射(DLS)结果显示POEI 1和POEI 2与DNA在质量比为2-32条件下能有效包裹质粒DNA形成粒径为200～300 nm、表面带有正电荷的纳米复合物颗粒,适合介导质粒进入细胞；同时由DLS分析验证了POEI/DNA复合物同样表现出良好的酸敏感性,在pH=5.0条件下,三种复合物粒径均发生不同程度的增大,表明复合物稳定性减弱,进而有利于DNA释放。此外,以25kDa PEI为对照物,通过一系列测试探讨了POEI作为基因载体的潜力和性能。本工作采用体外细胞毒性试验(MTT法)评价了POEI 1-3的生物相容性,与PEI (25 KD a)相比,三种聚合物(POEIs)与293T、SH-SY5Y、及HeLa细胞共培养均表现出较低的细胞毒性,其中POEI 3在高浓度下(100μg/mL)与三种细胞共培养后的细胞成活率也均超过80%。本文还通过流式细胞术定量测定法和荧光显微镜直接观察法进行体外细胞基因转染效率检测,结果显示,POEI 1 和 POEI2对于293T细胞系具有一定的转染性能,POEI 1与质粒DNA质量比为4时在293T细胞系中染效率最高达到7.63%。此外,在SH-SY5Y细胞系中,POEI 1和POEI 2的基因复合物在质量比为8时具有最佳转染效率,分别是25 kDa PEI的2.42倍和1.15倍,转染性能均优于25 kDa PEI, 而 POEI 3 在这两种细胞系中几乎没有转染性能。综上所述,这种基于低分子量PEI的pH敏感型基因载体(POEI 1口POEI2)在提高基因转染效率的同时降低了其细胞毒性、提高了生物相容性,再加上其优良的DNA结合能力,因此在基因治疗领域具有良好的应用前景。
【关键词】：基因治疗 原酸酯 聚乙烯亚胺 迈克尔加成
【学位授予单位】：安徽大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R450;Q78
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-11
• 第一章 绪论11-20
• 1.1 基因治疗概述11-12
• 1.2 非病毒基因载体(Non-viral Vector)12-14
• 1.2.1 阳离子聚合物(Cationic Polymer)12
• 1.2.2 常见的阳离子聚合物基因载体12-13
• 1.2.3 阳离子聚合物载体介导基因转染的一般过程13-14
• 1.3 聚乙烯亚胺(Polyethylenimine,PEI)14-17
• 1.3.1 高分子量PEI的修饰与改性15-16
• 1.3.2 低分子量PEI的修饰与改性16-17
• 1.4 含原酸酯的阳离子聚合物基因载体17
• 1.5 选题思路及研究内容17-20
• 第二章 基于原酸酯交联的低分子量PEI基因载体(POEI)20-37
• 2.1 引言20-21
• 2.2 实验试剂和仪器21-23
• 2.2.1 实验试剂21-22
• 2.2.2 实验仪器22-23
• 2.3 实验方法23-25
• 2.3.1 丙烯酸类原酸酯单体(OEAc)的合成23-25
• 2.3.2 聚合物POEI的合成25
• 2.4 合成产物的表征25-28
• 2.4.1 结构表征25-26
• 2.4.2 POEI的伯胺含量测定26
• 2.4.3 POEI质子缓冲能力的测定26
• 2.4.4 POEI的酸敏感性检测26-28
• 2.5 结果与讨论28-35
• 2.5.1 二羟基原酸酯单体(OEDg)的核磁共振谱图分析28-29
• 2.5.2 丙烯酸类原酸酯单体(OEAc)的核磁共振谱图分析29-30
• 2.5.3 聚合物POEI的表征30-35
• 2.6 本章小结35-37
• 第三章 POEI/DNA复合物的制备及表征37-51
• 3.1 引言37
• 3.2 实验试剂和仪器37-39
• 3.2.1 菌种与报告基因37
• 3.2.2 实验试剂37-38
• 3.2.3 实验仪器38-39
• 3.3 实验方法39-43
• 3.3.1 菌种培养与无内毒素质粒提取39-40
• 3.3.2 pEGFP-N1质粒的纯度及浓度测定40-41
• 3.3.3 聚合物POEI/DNA复合物的制备41
• 3.3.4 琼脂糖凝胶电泳阻滞实验41-42
• 3.3.5 肝素置换实验42
• 3.3.6 DNase Ⅰ酶降解实验42
• 3.3.7 POEI/DNA复合物的粒径以及Zeta电位测定42-43
• 3.3.8 POEI/DNA复合物酸敏感性分析43
• 3.4 结果与讨论43-50
• 3.4.1 凝胶电泳阻滞实验43-45
• 3.4.2 肝素置换实验45
• 3.4.3 DNase Ⅰ酶降解实验45-47
• 3.4.4 POEI/DNA复合物的粒径与Zeta电位47-48
• 3.4.5 POEI/DNA复合物的酸敏感性实验48-50
• 3.5 本章小结50-51
• 第四章 POEI的细胞毒性评价及其介导的体外基因转染研究51-62
• 4.1 引言51
• 4.2 实验试剂和仪器51-53
• 4.2.1 实验试剂51-52
• 4.2.2 实验仪器52-53
• 4.3 实验方法53-56
• 4.3.1 细胞培养53-54
• 4.3.2 细胞毒性实验54-55
• 4.3.3 聚合物介导DNA的体外转染实验55-56
• 4.4 结果与讨论56-61
• 4.4.1 POEI的细胞毒性56-57
• 4.4.2 POEI介导的体外基因转染57-61
• 4.5 本章小结61-62
• 结论62-63
• 参考文献63-71
• 致谢71-72
• 攻读学位期间发表的学术论文目录72

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4 要e，

本文编号：475909