耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因检测的电化学生物传感方法研究

发布时间：2017-06-29 11:19

  本文关键词：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因检测的电化学生物传感方法研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)是全球人类细菌感染的主要病原体。临床数据表明,MRSA感染的快速诊断和早期治疗对控制感染有积极影响。MRSA对甲氧西林的耐药机制主要是由青霉素结合蛋白(PBP2a)介导的,而这种结合蛋白的编码基因是葡萄球菌染色体mec(SCCmec)中的mec A基因,所以通过检测mec A基因中的一段特异性序列就可以快速直接评估金黄色葡萄球菌对甲氧西林的耐药性。本研究分别利用循环放大技术和级联识别策略制备两种电化学生物传感器,从基因水平对MRSA感染进行灵敏特异的检测,从而促进细菌感染的早期诊断。方法:1.两种电化学生物传感器的制备:基于等温链置换聚合酶反应(ISDPR)和底物循环放大策略构建超灵敏的电化学DNA传感器;基于级联DNA分支迁移技术和双信号识别系统构建高特异的电化学DNA传感器。用电化学阻抗谱法(EIS)、循环伏安法(CV)、原子力显微镜(AFM)、荧光分光光度法、琼脂糖凝胶电泳等方法对传感器每一步的修饰进行表征。2.分析电化学DNA传感器的可行性并优化其重要实验条件:如探针的固定顺序、比例、时间、温度和浓度,聚合酶的浓度和反应温度等。3.传感器性能考察及样本检测:考察两种传感器的分析性能,如检测线性范围、最低检测限、特异性、重复性和稳定性等。利用简单的信号转导机制输出电化学信号,用方波伏安法(SWV)检测电化学信号。结果:1.用不同的方法对两种电化学生物传感器的制备过程进行表征,不同方法共同验证电极的成功修饰和制备。2.基于ISDPR技术的电化学生物传感器各项性能:可灵敏地检测mec A基因;线性范围为0.075-200 p M;最低检测限为63 p M;重复性和稳定性良好。3.基于级联DNA分支迁移技术的电化学生物传感器各项性能:本检测方法展现了良好的分析性能;最低检测限是85 p M;具有高的单碱基突变识别能力。结论:本研究分别采用目标物循环放大策略和自发性的DNA分支迁移技术构建两种新颖电化学生物传感器来检测MRSA中的mec A基因。在ISDPR的信号放大作用下,显著地提高了传感器灵敏度,展现了良好的分析性能;在自发性地级联DNA分支迁移策略的双重识别作用下,显著地提高了检测特异性,实现对单碱基突变的识别。两种传感器均利用简单的信号转导机制显著地简化了电化学生物传感器的制备和检测过程。更重要的是,这两种电化学DNA传感器只需改变其相应的DNA序列就可以方便地应用于其他核酸链的检测。因此,这两种电化学生物传感器在生物医学研究、食品安全、早期临床诊断和环境监测中都具有很大的应用潜力。
【关键词】：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 链置换聚合酶反应 DNA分支迁移 级联识别 电化学生物传感器
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R446.5
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照5-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-16
• 第一部分 基于目标循环放大和等温链置换聚合酶反应的电化学生物传感器16-27
• 1 实验部分16-18
• 1.1 试剂与仪器16
• 1.1.1 试剂16
• 1.1.2 仪器16
• 1.2 电化学核酸传感器的制备16-18
• 1.2.1 金电极的预处理16-17
• 1.2.2 金电极的修饰17
• 1.2.3 电化学传感器对mec A基因的检测17-18
• 2 结果与分析18-26
• 2.1 生物传感器的表征18-20
• 2.1.1 电化学阻抗法表征18-19
• 2.1.2 循环伏安法表征19
• 2.1.3 原子力显微镜表征19-20
• 2.2 电化学传感器的可行性分析20-21
• 2.3 检测条件的优化21-23
• 2.4 电化学生物传感器的分析性能23-24
• 2.5 电化学生物传感器的特异性、重复性和稳定性24-26
• 3 小结26-27
• 第二部分 耦合自发的级联DNA分支迁移技术和双信号传感策略的高特异性电化学DNA生物传感器27-39
• 1 实验部分27-30
• 1.1 试剂与仪器27
• 1.1.1 试剂27
• 1.1.2 仪器27
• 1.2 电化学核酸传感器的制备27-28
• 1.2.1 金电极的预处理27-28
• 1.2.2 金电极的修饰28
• 1.3 电化学信号检测28-30
• 1.4 实时荧光检测30
• 1.5 琼脂糖凝胶电泳30
• 2 结果与分析30-37
• 2.1 生物传感系统的表征30-32
• 2.2 双信号电化学传感器的可行性分析32-33
• 2.3 各种条件的优化33-35
• 2.4 电化学DNA传感器的性能分析35-37
• 2.5 电化学生物传感器的特异性37
• 3 小结37-39
• 全文总结39-40
• 参考文献40-45
• 文献综述45-56
• 1 前言45-46
• 2 MRSA46
• 3 检测方法46-52
• 3.1 传统检测方法47
• 3.2 基于MEMS的方法47-51
• 3.3 商品化的产品51-52
• 4 总结52-53
• 参考文献53-56
• 致谢56-57
• 攻读硕士学位期间的研究成果及发表的学术论文57

【相似文献】

中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 汪婷;耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因检测的电化学生物传感方法研究[D];重庆医科大学;2016年

  本文关键词：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因检测的电化学生物传感方法研究，由笔耕文化传播整理发布。

，

本文编号：497709