万古霉素耐药肠球菌的分子特征及肠球菌感染小鼠代谢组学分析

发布时间：2017-07-03 01:12

  本文关键词：万古霉素耐药肠球菌的分子特征及肠球菌感染小鼠代谢组学分析

  更多相关文章： 肠球菌 万古霉素耐药 基因型 脓毒症 非靶向代谢组学 靶向代谢组学 LC-MS/MS 生物标志物

【摘要】：目的 对实验室保存的325株肠球菌进行万古霉素非敏感菌筛选,并对筛选出的菌株进行耐药表型、耐药基因型、菌株同源性分析；建立粪肠球菌ATCC 29212和ATCC 51299感染Balb/c小鼠脓毒症模型；建立基于液相质谱联用技术非靶向与靶向代谢组学相结合的分析方法,开展肠球菌感染小鼠脓毒症代谢组学分析,寻找疾病状态下生物标志物,分析小鼠感染过程中可能影响的代谢通路。方法采用琼脂平皿二倍稀释法或肉汤微稀释法筛选万古霉素非敏感菌,并检测菌株对替考拉宁的敏感性；采用PCR方法检测万古霉素非敏感肠球菌的耐药基因型；通过肠道细菌基因间重复一致序列(ERIC) PCR技术、脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术、多位点序列分型(MLST)技术进行菌株的同源性分析。建立粪肠球菌ATCC 29212和ATCC 51299腹腔感染小鼠脓毒症模型,通过血培养确证模型的成功,在小鼠感染前后进行白细胞计数,通过酶联免疫吸附法(ELISA)测定降钙素原(PCT)、C反应蛋白(CRP)含量,监测小鼠脓毒症发生发展过程中状态的变化。建立基于液相质谱(LC-MS)技术的血浆非靶向代谢组学分析方法,应用于粪肠球菌ATCC 29212感染小鼠后4h、8h、24h的血浆样本分析,建立多元统计模型,通过S-plot图,VIP list, Jack-knifed置信区间图,独立样本t-test筛选差异性代谢物,对得到的差异性代谢物进行代谢物富集分析和代谢途径分析,获取小鼠脓毒症发生发展过程中可能相关的代谢通路。以非靶向代谢组学发现的差异性代谢物和文献中报导的部分生物标志物为对象,建立基于LC-MS/MS技术的靶向代谢组学分析方法,对方法的精密度和灵敏度进行考察,并应用于肠球菌ATCC 29212和ATCC 51299感染小鼠靶向代谢组学分析,结合独立样本t检验,筛选潜在生物标志物。结果从325株临床分离肠球菌中共筛选出17株万古霉素非敏感菌,包括1株粪肠球菌、11株屎肠球菌和5株鹑鸡肠球菌。其中1株粪肠球菌和11株屎肠球菌对万古霉素高水平耐药,对替考拉宁耐药或中介耐药,PCR检测结果显示vanA型：5株鹑鸡肠球菌对万古霉素中介耐药,对替考拉宁敏感,PCR检测结果显示vanC1型。ERIC同源性分析显示同基因型的大多数菌株显示相似的ERIC分型；PFGE同源性分析显示,17株临床万古霉素非敏感肠球菌分型不同,不属于单克隆流行播散；MLST同源性分析显示,1株临床万古霉素非敏感粪肠球菌属于ST4,11株临床万古霉素非敏感屎肠球菌共分为6个ST型,其中4株属于ST78,是屎肠球菌出现频率最高的ST型。在肠球菌感染小鼠非靶向代谢组学分析中,成功建立了肠球菌感染小鼠脓毒症模型,采用基于LC-MS技术的非靶向代谢组学分析,对空白对照组与感染后4h、8h、24h组小鼠进行两两比对分析,在ESI正离子检测模式下分别得到了69种、69种、61种差异性代谢物,在负离子检测模式下分别得到了99种、91种、90种差异性代谢物,综合两两比对结果,最终得到了95种差异性代谢物,其中21种差异性代谢物在整个感染过程中均有显著的变化。代谢物富集分析和代谢通路分析结果推测脓毒症影响氨基酸代谢、磷脂代谢、三羧酸循环、亚油酸和亚麻酸代谢、尿素循环。以40种差异性代谢物为对象,建立靶向代谢组学分析方法,针对粪肠球菌ATCC 29212和ATCC 51299感染小鼠脓毒症模型进行分析,最终在粪肠球菌ATCC 29212感染小鼠脓毒症模型中筛选出17种潜在生物标志物,在粪肠球菌ATCC 51299感染小鼠脓毒症模型中筛选出12种潜在生物标志物。结论我国万古霉素耐药菌在粪肠球菌中分离率较低,但屎肠球菌中万古霉素耐药情况较严重,并且耐药菌株携带易于传播和转移的vanA基因。同源性分析结果显示万古霉素耐药存在同源性传播的可能性；在粪肠球菌ATCC 29212感染小鼠脓毒症模型中发现的17种潜在生物标志物中,感染动物体内牛磺酸、胸苷、胞苷、肌酸、谷氨酰胺、2-甲基苹果酸、核黄素、柠檬酸8种代谢物含量上升,而PE(P-16：0/0：0)、肌苷、可的松、马尿酸、吲哚、色氨酸、龙胆酸、蛋氨酸、丙酮酸9种代谢物含量下降：在粪肠球菌ATCC 51299感染小鼠脓毒症模型中发现的12种潜在生物标志物中,PE(P-16：0/0：0)、色氨酸、丙酮酸、吲哚、可的松、龙胆酸、瓜氨酸、马尿酸、桂皮酸9种代谢物含量下降,胞苷、胸苷、组氨酸3种代谢物含量上升。两株菌感染小鼠脓毒症模型中9个潜在生物标志物相同,具有相似的结果。通过生物标志物之间的相关性和代谢途径考察,分析推断肠球菌感染小鼠脓毒症模型影响氨基酸代谢、磷脂代谢及能量代谢过程。
【关键词】：肠球菌 万古霉素耐药 基因型 脓毒症 非靶向代谢组学 靶向代谢组学 LC-MS/MS 生物标志物
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R446.5
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-9
• 缩略语表9-11
• 前言11-16
• 第一部分 万古霉素耐药肠球菌的筛选和基因型分析16-33
• 1 实验材料16-19
• 2 实验方法19-26
• 3 结果26-30
• 4 讨论30-32
• 5 小结32-33
• 第二部分 肠球菌感染小鼠脓毒症非靶向代谢组学分析33-52
• 1 实验材料33-34
• 2 实验方法34-37
• 3 结果37-49
• 4 讨论49-51
• 5 小结51-52
• 第三部分 肠球菌感染小鼠靶向代谢组学分析52-74
• 1 实验材料52-53
• 2 实验方法53-56
• 3 结果56-72
• 4 讨论72-73
• 5 小结73-74
• 参考文献74-80
• 文献综述80-89
• 参考文献86-89
• 个人简历及在校期间发表的学术文章89-90
• 致谢90-91

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本文编号：511908