不对称荧光PCR扩增白念珠菌ITS-2基因单链DNA实验

发布时间：2017-07-04 17:09

  本文关键词：不对称荧光PCR扩增白念珠菌ITS-2基因单链DNA实验

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【摘要】：目的比较在限制性引物不同稀释比例条件下,不对称荧光聚合酶链反应(PCR)扩增白念珠菌5.8S rDNA与28S rDNA间内转录间区2(ITS-2)基因的单链DNA(ssDNA)的实际效果,探讨其体系优化方法。方法以常规PCR为对照,将20μmol/L的正向引物(P1)按照一定比例预稀释后,分别与20μmol/L的荧光标记反向引物(P2')组成含不同P1水平的引物对,采用不对称荧光PCR扩增真菌ITS-2,并对PCR产物进行电泳和测序分析,比较各实验组扩增ssDNA的效果。结果不对称荧光PCR成功扩增出白念珠菌ITS-2基因的ssDNA,随着限制性引物水平的降低,ITS-2基因的双链DNA(dsDNA)条带逐渐变淡,而ssDNA条带逐渐变亮;在限制性引物稀释比例达到1∶90~1∶100时,ds DNA条带已经模糊不清,而ssDNA条带则达到最亮。提示在此扩增体系条件下,ssDNA拷贝数最多,为不对称荧光PCR扩增白念珠菌ITS-2基因ssDNA的最佳扩增条件。PCR产物测序也表明,dsDNA上方的条带为ITS-2基因的ssDNA。结论通过优化限制性引物水平,不对称荧光PCR可以高效地扩增白念珠菌ITS-2基因的ssDNA。
【作者单位】： 上海市临床检验中心临床微生物室;苏州大学附属第二医院检验科;
【关键词】： 不对称荧光聚合酶链反应 白念珠菌 ITS-基因 单链DNA
【基金】：上海市卫生和计划生育委员会重点资助项目(20134010) 上海市自然科学基金项目(15ZR1436100)
【分类号】：R440
【正文快照】： 近年来,深部真菌感染的发病率大幅增加,特别是深部丝状真菌感染的发病率正逐年明显增加,在某些特定人群中其发病率甚至高于酵母样真菌感染[1]。由于深部真菌感染早期诊断困难,且不同真菌对抗真菌药物的敏感性存在较大差异[2],致使真菌引起的深部感染死亡率很高。因此,提高真菌

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