FGFR3负调控骨髓损伤修复中的小鼠造血干细胞增殖

发布时间：2017-08-09 11:08

  本文关键词：FGFR3负调控骨髓损伤修复中的小鼠造血干细胞增殖

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【摘要】：背景和目的:众所周知,造血干细胞是(hematopoietic stem cells,HSCs)是一少部分能够产生出所有成熟细胞和免疫细胞的原始造血细胞,具有自我更新能力和多向分化能力,是维持体内各类血细胞稳定的细胞群体。目前多种恶性疾病,比如白血病,自身免疫性疾病等的有效治疗方法就是进行HSCs移植。但由于HSCs数量较少,难以满足临床治疗的需要,使HSCs的临床应用受到严重制约。因此如何高效的扩增大量的HSCs以满足临床需要已成为HSCs移植亟待解决的问题。已有研究证实FGF信号对造血干细胞的自我更新、维持、发育和骨髓的恢复有重要作用。在体内,FGF2能够促进间充质干细胞祖细胞和造血干细胞祖细胞的扩增。FGF1能够促进由5-FU引起的骨髓损伤后的修复以及增强AMD3100诱发的干细胞的动员作用。FGFR3作为FGF的一个重要的受体,已有研究证明FGFR3在骨髓HSCs中表达水平较高。那么FGFR3对HSCs的增殖有什么调控作用呢?对本文就以此为出发点探讨FGFR3对HSCs体内扩增的调控作用。方法:1.首先建立Fgfr3敲除型小鼠。2.我们主要采用台盼蓝染色进行总细胞计数,根据细胞表面标记,通过流式细胞术分析WT和KO小鼠中骨髓和脾脏中LSK的比例,进而分析LSK细胞的总数。3.通过Brd U标记法检测HSCs的增殖能力。4.流式细胞仪分析FGFR1的表达。5.通过细胞内蛋白染色分析NF-κB及STAT1的磷酸化水平。6.RT-PCR检测p15的m RNA表达水平。7.经过骨髓移植探究FGFR3对造血重建能力及HSCs分化能力的影响。结果:1.在稳态下,骨髓的总细胞数及LSK细胞数在WT和KO中没有差别。2.骨髓中HSCs分化为粒细胞(Gr1+/CD11b+),B细胞(B220+)和T细胞(CD3e+)的水平,同样也是没有差别。3.在给予化疗药物5-FU处理14天后,KO小鼠中骨髓和脾脏中的HSCs数量分别是WT的2.1倍和1.8倍。3.KO HSCs的Brd U的阳性率是WT的1.5倍。4.流式细胞术分析在给予5-FU后,KO小鼠HSCs的FGFR1、p-NF-κB的表达水平明显上调。5.给予5-FU处理后,STAT1的磷酸化程度降低。6.细胞增殖周期的抑制基因p15 m RNA的表达量下降。7.骨髓移植后WT和KO两种BM细胞在受者体内的重建造血能力及HSCs的分化能力均没有差别。结论:我们证明在骨髓损伤修复中同时有两条FGF-FGFR信号通路影响到HSCs的扩增。一条是已经被证明的FGF1-FGFR1信号通路,促进HSCs增殖;另一条是FGF1-FGFR3信号通路,抑制HSCs的增殖。在本实验中我们第一次提出FGFR3在小鼠骨髓受损后修复过程中对HSCs在体内扩增的负调控作用。为在体外大量扩增HSCs实现造血干细胞移植提供理论依据。
【关键词】：FGFR3 造血干细胞 增殖 骨髓损伤修复
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R457.7
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-8
• 英文缩略词汇8-11
• 第1章 绪论11-20
• 1.1 造血干细胞概述11-15
• 1.1.1 造血干细胞的生物学特性11-12
• 1.1.2 小鼠造血干细胞的主要表面标记12-14
• 1.1.3 造血干细胞的体外培养14
• 1.1.4 造血干细胞的应用14-15
• 1.2 FGFR3结构和功能概述15-18
• 1.2.1 FGFR3的结构特性15-16
• 1.2.2 FGFR3与疾病的关系16-18
• 1.3 FGF信号与HSCs18-19
• 1.4 本课题的研究思路19-20
• 第2章 材料和方法20-33
• 2.1 仪器与试剂20-23
• 2.1.1 主要的试剂20
• 2.1.2 抗体20
• 2.1.3 主要仪器20-21
• 2.1.4 实验试剂的配方21-23
• 2.1.5 实验动物23
• 2.2 实验方法23-33
• 2.2.1 小鼠基因型的鉴定23-25
• 2.2.2 小鼠骨髓细胞的分离25-26
• 2.2.3 小鼠脾脏细胞的分离26
• 2.2.4 台盼蓝染色法细胞计数26-27
• 2.2.5 BrdU标记法检测细胞增殖27-28
• 2.2.6 流式细胞术分析HSCs胞内蛋白的表达28
• 2.2.7 CD117+造血干/祖细胞中的p15 mRNA表达检测28-31
• 2.2.8 骨髓移植31-32
• 2.2.9 造血重建实验32-33
• 第3章 实验结果33-48
• 3.1 小鼠基因型鉴定33-35
• 3.2 稳态下FGFR3对小鼠骨髓HSCs增殖和分化的影响35-36
• 3.3 5-FU处理后FGFR3对小鼠HSCs增殖的影响36-42
• 3.4 BrdU分析42-43
• 3.5 FGFR1表达检测43-44
• 3.6 FGFR1通过激活NF-κB促进HSCs增殖44-45
• 3.7 FGFR3通过激活STAT1负调控HSCs扩增45
• 3.8 抑制细胞增殖周期的基因p15表达的检测45-46
• 3.9 造血重建实验46
• 3.10 骨髓移植后造血细胞的分化情况46-48
• 第4章 实验结论48-49
• 第5章 实验讨论49-53
• 参考文献53-64
• 致谢64

【参考文献】

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1 许力;毛平;;白细胞介素3与白细胞介素6对人脐血单个核细胞体外扩增及黏附分子和趋化因子受体4表达的影响[J];中国组织工程研究与临床康复;2009年01期

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本文编号：644946