甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌临床分离株的分子分型及耐药性分析

发布时间：2017-08-14 01:10

  本文关键词：甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌临床分离株的分子分型及耐药性分析

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【摘要】：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),简称金葡菌,不仅是医院内获得性感染的重要病原菌,而且在社区获得性感染中,金葡菌也是引起皮肤、软组织等感染的主要原因。金葡菌的致病作用多样,可引起多种感染性疾病,从轻度的皮肤、软组织感染到危及生命的败血症、心内膜炎、肺炎等,严重危害人类健康。金葡菌除可以表达多种毒力因子致病外,更为人们所忌惮的是其对抗生素耐药的快速形成能力。近年来,随着抗生素的广泛应用,特别是广谱抗生素的使用,金葡菌的耐药形势日益严峻,耐3种以上抗生素的多重耐药菌检出比例越来越高。以往的研究大多关注于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant S.aureus,MRSA),然而仍然有相当部分的感染是由甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(methicillinsusceptible S.aureus,MSSA)引起,在我国MSSA感染约占金葡菌感染的40%,但是对于MSSA的分子特征还缺乏了解。在分子型别上,与MRSA相比,MSSA表现出更高的遗传多样性。在特定地区,MSSA的流行无明显的优势克隆,常常多种分子型别的菌株并存,我国不同的研究中报道的主要MSSA型别也存在差异。研究发现,MSSA携带的多种毒力因子,如肠毒素、杀白细胞素等的表达水平比MRSA高。此外,MSSA菌获得SCCmec耐药盒后即转化为MRSA,是MRSA的重要来源。一般认为,MSSA对除青霉素外的大多数抗生素敏感,然而近年来的研究发现MSSA的耐药水平逐年升高,多重耐药菌株检出率持续上升。分析MSSA临床菌株的分子特征和耐药表型对于鉴定菌株间亲缘关系、有效控制MSSA的感染和传播具有重要现实意义。在我国,MSSA感染仍然占金葡菌感染的40%左右,然而,现有的研究报道常与对MRSA的分析同时进行,以MRSA为主,尚未见专门针对MSSA的研究报道,对MSSA的分子特征所知有限。本研究对2012年6月至2013年12月期间收集于重庆和乌鲁木齐两座城市的115株MSSA临床菌株进行了研究,综合运用多种分子分型方法,分析菌株的分子特征,在此基础上对菌株的抗生素耐药谱进行检测,探讨菌株分子特征与耐药表型之间的关系。所得结果不仅可以在一定程度上揭示我国MSSA的流行现状,探讨其分子特征与耐药表型的关系,也可以丰富我国金葡菌的分子流行病学资料,为进一步研究金葡菌耐药机制,指导临床抗生素合理应用,防控金葡菌感染提供重要实验依据。主要研究内容和研究结果如下:1.MSSA的分子分型研究(1)葡萄球菌A蛋白基因多态性分析(spa分型):用PCR方法扩增spa基因的X区,测序后获得连续的24bp重复序列,从数据库(http://spaserver.ridom.de/)中得到每个24bp重复序列相对应的编号,再根据编号和排列顺序确定菌株的spa型别。结果115株MSSA菌株共获得45个spa型别,主要型别有t11413(8.7%,10株)、t571(6.1%,7株)和t7164(6.1%,7/115),这三种型别占所有菌株的20.9%,另有11株可能为新的spa型别。(2)多位点序列分析(MLST分型):根据金葡菌7个管家基因(arc,aro E,glp F,gmk,pta,tpi,yqi L)的多态性确定其型别。首先分别PCR扩增每株菌的7个管家基因,测序后提交数据库(http://saureus.mlst.net/)获得每个管家基因的序号,然后按顺序依次排列,获得其ST型别,与已知的金葡菌流行株进行比较。115株MSSA菌可分为26个ST型,其中主要型别有ST121(11.3%,13株)、ST15(11.3%,13株)、ST7(10.4%,12株)、ST22(10.4%,12株)、ST398(7.0%,8株)、ST188(6.1%%,7株)以及ST88(5.2%,6株),占所有MSSA菌株的61.7%。(3)金葡菌附属基因调节子(agr)分型:金葡菌agr位点的可变区包含编码Agr D的基因序列、编码Agr B的C末端2/3的序列和编码Agr C的N末端的部分序列。不同金葡菌菌株的agr位点可变区呈现出多态性,利用这一点可将金葡菌分为4种不同的agr型别。115株MSSA菌株共检出agr I型71株(61.7%)、agr II型17株(14.8%)、agr III型13株(11.3%)、agr IV型14株(12.2%)。(4)脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型:先将金葡菌包埋于琼脂中,然后用适当的内切酶在原位对细菌的整个染色体进行酶切,电泳时通过不断交替变换电场方向和脉冲时间,使酶切片段在电泳系统中得到较好的分离,最后电泳结果进行聚类分析。结果107株MSSA分离株可分为10个聚类组,依次命名为A-J,其中A型(26.2%,28/107)、B型(26.2%,28/107)和F型(23.4%,25/107)为优势型别,占所有MSSA菌株的75.8%(81/107)。8株ST398型菌株无法分型。(5)杀白细胞毒素毒力基因(pvl)检测:115株MSSA中有33株显示pvl基因阳性,阳性率为28.7%。2.MSSA的耐药性分析检测了115株MSSA对13种临床常用抗生素的耐药情况,结果所有菌株对苯唑西林,利奈唑胺,万古霉素,替考拉宁都敏感;仅有1株对利福平中介耐药;对复方新诺明(28.7%,33/115)、四环素(18.3%,21/115)、庆大霉素(7.8%,9/115)、环丙沙星(5.2%,6/115)、左氧氟沙星(2.6%,3/115)呈不同程度的低水平耐药;而对青霉素(83.4%,96/115)、红霉素(60.0%,69/115)和克林霉素(51.3%,59/115)呈高水平耐药。通常将对3类以上(含3类)抗生素耐药的细菌定义为多重耐药菌(multidrug-resistant,MDR)。我们的检测表明47.8%(55/115)的MSSA菌株为MDR菌株,其中大多数(89.1%,49/55)至少对青霉素、红霉素和克林霉素3种抗生素耐药。用PCR方法检测所有MSSA菌株这3种抗生素耐药基因的携带情况,结果青霉素耐药基因bla Z的携带率为91.3%(105/115),红霉素、克林霉素耐药基因erm A、erm C携带率分别为30.4%(35/115)、92.2%(106/115)。结合MSSA菌株的分子特征来看,4株ST943型菌都为MDR菌株;13株ST121型菌中有9株为MDR菌株(69.2%),而且大多数(88.9%,8/9)有共同的耐药谱(PEN-ERYCLI);3株ST398型MDR菌株都对至少4类抗生素耐药。此外,大多数(76.0%,19/25)PFGE F型菌株属于多重耐药菌,其中包含一株(ST45-t1081)对7种抗生素耐药。综上所述,本研究通过分子分型分析揭示了我国重庆及乌鲁木齐地区MSSA的主要种群结构,通过耐药性分析发现了较高的MDR检出率。所分析的MSSA临床菌株具有高度的遗传多样性,优势流行克隆不明显,除国内经常存在的t571外,t11413和t7164也占据一定地位。具有高毒力、高耐药性的ST121克隆在我国以往的报道中少见,在本研究中具有一定优势,值得高度关注。上述结果为了解MSSA的流行病学特征提供了重要实验依据,尽管MRSA仍然是金葡菌感染的主要问题,但是MSSA因为其较强的毒力和日益增长的耐药性也应引起足够的重视。
【关键词】：甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌 流行病学 分子分型 多重耐药 药敏试验
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R446.5
【目录】：

• 缩略语表4-6
• 英文摘要6-10
• 中文摘要10-13
• 第一章 前言13-17
• 1.1 选题缘由13
• 1.2 研究背景13-14
• 1.3 研究意义14-15
• 1.4 研究内容15
• 1.5 方法15-17
• 第二章 MSSA临床分离株的分子分型17-43
• 2.1 材料与方法18-30
• 2.2 结果30-40
• 2.3 讨论40-43
• 第三章 MSSA临床分离株的耐药性分析43-52
• 3.1 材料与方法43-46
• 3.2 结果46-50
• 3.3 讨论50-52
• 第四章 全文总结52-54
• 参考文献54-60
• 文献综述 金黄色葡萄球菌分子分型研究现状60-80
• 参考文献73-80
• 攻读学位期间的研究成果及参与的课题80-81
• 致谢81

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