核酸生物传感器在临床检验诊断中的应用探索

发布时间：2017-08-14 09:07

  本文关键词：核酸生物传感器在临床检验诊断中的应用探索

  更多相关文章： 电化学DNA传感器 转甲基酶 邻位连接反应 热力学和动力学常数 级联识别反应

【摘要】：核酸生物传感器是20世纪90年代中期逐渐发展起来的一种新的传感器技术。核酸传感器以DNA作为敏感元件,通过换能器将DNA与待测物质之间相互作用的生物信号转变为可测的信号。与传统方法相比,DNA生物传感器具有快速、灵敏、操作简单、特异性强、适合于POCT检测等特点。根据换能器的不同,DNA传感器可以分为电化学,荧光,石英晶体微天平和场效应晶体管DNA传感器。近年来DNA传感器在基因诊断,环境监控,药物研究等领域的应用受到广泛重视。在本论文中,我们运用电化学生物传感器进行了Dam转甲基酶的检测,并尝试对核酸自主装进行机制阐释;运用荧光分析法建立了对人工合成短链核酸实现特异性检测的荧光传感器。1.基于邻位连接反应和金纳米颗粒协同放大作用的生物传感器检测甲基转移酶活性本节描述了一种基于insertion法、甲基化抵抗酶切作用、金纳米颗粒富集作用和邻位杂交反应的turn-on电化学生物传感器用来检测甲基转移酶引起的DNA腺嘌呤甲基化。包含Dam甲基转移酶和Mbo I酶切位点的双链DNA首先通过金-硫配位键固定于金电极表面。紧接着分别用Dam甲基转移酶和Mbo I限制性内切酶进行处理,试验结果显示经过上述处理后电极上存在甲基化的ds DNA和12 nt的残留核苷酸。由于链霉亲和素-生物素之间的高亲和作用使得信号探针与残留核苷酸杂交,金纳米颗粒的富集作用使得大量的信号分子靠近金电极表面。在最优反应条件下,DPV信号与Dam转甲基酶在0.1-40 U?m L-1线性相关,其动态范围为0.05-50 U?m L-1,最低检测限为0.024 U U?m L-1(S/N=3规则)。传感器展现了良好的稳定性、特异度和抗干扰能力,该传感器在核酸分析和转甲基酶加测等方面具有广泛的应用价值。2.Insertion法在金电极表面固定探针以提高探针杂交效率的试验研究电化学核酸传感器的分析性能与传感器表面核酸探针的组装密切相关。通过两步backfilling法固定巯基化的核酸探针和MCH是制作核酸传感界面的最常用方法。在本节中,我们展现出了通过insertion法在已有MCH层插入巯基化DNA从而获得传感器识别界面的新方法。运用计时电量法来表征backfilling法和insertion法捕获探针的密度和杂交效率。我们发现通过insertion方法获得的传感界面优于backfilling法。为了进一步阐述其反应机制,我们分别从动力学和热力学两反面进行了阐述。3.基于链置换级联反应实现核酸的特异性检测在本节中,我们阐述了一种基于级联核酸链置换反应以在常温下实现核酸特异性检测的方法。级联链置换反应由toehold介导的链置换反应和双链链置换反应构成,这样可以保证该方法具有区别靶核酸中点突变的能力。该方法对于模拟靶基因的识别因子在45-109,平均为70。该级联链置换反应在均相溶液中进行、易于操作、无酶、常温下即可进行,有望进一步运用于高通量核酸分析。
【关键词】：电化学DNA传感器 转甲基酶 邻位连接反应 热力学和动力学常数 级联识别反应
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R440;TP212.3
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照4-6
• 中文摘要6-9
• ABSTRACT9-13
• 第一部分 基于邻位连接反应和金纳米颗粒协同放大作用的生物传感器检测甲基转移酶活性13-28
• 前言13-14
• 1 材料与方法14-16
• 2 试验结果16-24
• 3 总结24-25
• 参考文献25-28
• 第二部分 Insertion法在金电极表面固定探针以提高探针杂交效率的试验研究28-38
• 前言28-29
• 1 材料与方法29-30
• 2 试验结果30-34
• 3 总结34-36
• 参考文献36-38
• 第三部分 基于链置换级联反应实现核酸的特异性检测38-54
• 前言38-40
• 1 材料和方法40-41
• 2 试验结果41-51
• 3 总结51-52
• 参考文献52-54
• 致谢54-55
• 攻读硕士学位期间的研究成果及发表的学术论文55

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本文编号：671851