PEG化基因传递体系的构建及其形貌调控

发布时间：2017-08-17 06:13

  本文关键词：PEG化基因传递体系的构建及其形貌调控

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【摘要】：高效安全的基因传递体系的构建是限制基因治疗临床应用的关键问题。目前优化基因传递体系的常用手段是化学改性,例如,基于细胞内外微环境的差异设计刺激响应的基因传递体系,实现载体所需要的细胞外稳定传递、细胞内响应解离并高效转染的功能。这种化学改性得到的组装体形貌多为球形结构,研究表明粒子的微观形貌可以影响细胞内吞、体内循环时间等生物过程,从而影响基因转染效率。因此,本论文工作主要分为以下两个部分：一.依据溶酶体中较低的pH值,构建pH响应的PEG化基因传递体系,实现细胞外稳定传递和细胞内有效解离并高效转染。我们制备了苯甲酰亚胺键偶联的聚乙二醇接枝聚乙烯亚胺(PEI-N=CH-mPEG),并以还原后不含苯甲酰亚胺键的聚合物PEI-NH-CH2-mPEG作为对照,来研究细胞内PEG壳层的脱离对基因传递体系的影响。结果显示：PEG链段的引入并没有影响对脱氧核糖核酸(DNA)的缔合,形成尺寸为80 nm、表面电位为10 mV左右的球形纳米粒子,具有很好的生理盐稳定性。在模拟溶酶体的酸性环境下,苯甲酰亚胺键能有效断裂,显示出很好的pH响应特性。人肝癌细胞(HepG2)培养结果表明：由于PEG有效屏蔽了组装体表面的正电荷,PEG化组装体的细胞毒性和内吞效率显著降低,但由于在溶酶体酸性条件下苯甲酰亚胺键的断裂,利于组装体逃离溶酶体,因此PEI-N=CH-mPEG具有比PEI-NH-CH2-mPEG更高的基因转染效率,实现了基因载体细胞外稳定传递、细胞内响应解离并高效转染的功能。二.将基于主客体作用的超分子自组装引入到载体设计中,实现对载体形貌的调控,初步探讨形貌对基因传递体系的影响。我们合成了双硒键和碳碳键偶联的聚乙二醇接枝聚乙烯亚胺PEI-SeSe-mPEGsk和PEI-mPEG2k,在酸性条件下,α-环糊精(α-CD)选择性与PEG进行主客体作用,形成项链状刚性链段PEG/a-CD。调控α-CD的加入量,实现组装体中刚性链段比例的调控。当α-CD加入量较少时,刚性链段所占比例较小,未包裹α-CD的部分mPEG链段和mPEG/a-CD形成胶束的核,质子化PEI形成胶束的空间稳定层；随着α-CD的加入量逐渐增多,刚性链段比例的逐渐增大,质子化PEI的稳定作用不足以维持胶束的稳定,刚性链段彼此平行排列形成片层结构。以PEI-mPEG2k/α-CD自组装得到的球形和片层结构为模型,研究两种形貌对DNA缔合能力和HepG2田胞内吞的影响。结果表明,片层结构具有较好的DNA浓缩能力,并且在相同质量比下,球形结构的细胞内吞效率优于片层结构,这可能是内吞方式不同引起的。我们基于主客体的超分子自组装,成功得到不同形貌的组装体,并研究了形貌对基因传递体系的影响。
【关键词】：非病毒基因载体 刺激响应 自组装 形貌调控
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R450
【目录】：

• 致谢5-7
• 摘要7-9
• Abstract9-13
• 第一章 绪论13-35
• 1.1 基因治疗概述13-19
• 1.1.1 基因治疗现状13-14
• 1.1.2 基因载体种类14-17
• 1.1.3 非病毒基因传递的屏障17-19
• 1.2 非病毒基因传递体系的优化19-31
• 1.2.1 基因载体的化学改性19-23
• 1.2.2 基因载体的形貌调控23-31
• 1.3 课题提出31-35
• 1.3.1 pH响应的PEG化基因传递体系的研究32-33
• 1.3.2 基于主客体作用的超分子组装体的形貌调控33-35
• 第二章 pH响应的PEG化基因传递体系的研究35-53
• 2.1 实验部分35-40
• 2.1.1 试剂35-36
• 2.1.2 PEI-N=CH-mPEG和PEI-NH-CH_2-mPEG合成与表征36
• 2.1.3 基因超分子组装体的制备36-37
• 2.1.4 基因超分子组装体理化性质的表征37-38
• 2.1.5 基因超分子组装体在生理盐溶液和血清中的稳定性38
• 2.1.6 基因超分子组装体的pH响应特性研究38
• 2.1.7 基因超分子组装体的体外生物学评价38-40
• 2.2 结果与讨论40-51
• 2.2.1 PEI-N=CH-mPEG和PEI-NH-CH_2-mPEG的合成及表征40-41
• 2.2.2 基因超分子组装体理化性质的表征41-45
• 2.2.3 基因超分子组装体的稳定性及pH响应特性研究45-48
• 2.2.4 基因超分子组装体的体外生物学评价48-51
• 2.3 本章小结51-53
• 第三章 基于主客体作用的超分子组装体的形貌调控53-68
• 3.1 实验部分53-58
• 3.1.1 试剂53-54
• 3.1.2 PEI-SeSe-mPEG_(5k)和PEI-mPEG_(2k)的合成及表征54-56
• 3.1.3 PEI-SeSe-mPEG_(5k)/α-CD和PEI-mPEG_(2k)/α-CD超分子组装体的制备及表征56
• 3.1.4 DNA/PEI-mPEG_(2k)/α-CD基因超分子组装体的制备及表征56-57
• 3.1.5 DNA/PEI-mPEG_(2k)/α-CD基因超分子组装体的细胞内吞实验57-58
• 3.2 结果与讨论58-66
• 3.2.1 PEI-SeSe-mPEG_(5k)和PEI-mPEG_(2k)的合成及表征58-60
• 3.2.2 PEI-SeSe-mPEG_(5k)/α-CD和PEI-mPEG_(2k)/α-CD超分子自组装体的制备及表征60-63
• 3.2.3 DNA/PEI-mPEG_(2k)/α-CD基因超分子组装体的制备及表征63-65
• 3.2.4 DNA/PEI-mPEG_(2k)/α-CD基因超分子组装体的细胞内吞实验65-66
• 3.3 本章小结66-68
• 第四章 全文总结68-70
• 4.1 全文总结68-69
• 4.2 特色与创新69
• 4.3 问题与展望69-70
• 参考文献70-82
• 作者简介82

【参考文献】

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1 孔韵娜;李文宇;杜建委;汤建国;胡巧玲;王幽香;;刺激响应双硒交联聚乙烯亚胺基因微载体[J];高等学校化学学报;2014年04期

2 王幽香;陈平;胡巧玲;沈家骢;;自组装共混制备PEG化基因载体[J];高等学校化学学报;2008年11期

3 王幽香,沈家骢;超分子组装构建非病毒基因传递体系的研究进展[J];科学通报;2004年09期

4 高川,王惠芳,张靖;脂质体介导转染法的原理与应用[J];生命的化学;2002年01期

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本文编号：687457