毛囊源性间充质干细胞在小鼠体内迁移及归巢的实验研究

发布时间：2017-08-20 00:01

  本文关键词：毛囊源性间充质干细胞在小鼠体内迁移及归巢的实验研究

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【摘要】：研究背景:间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞。MSCs具有来源广泛、易于获取、免疫原性低、无致瘤性、应用不涉及伦理学等的优点,可作为理想的种子细胞,用于抗衰老和组织的损伤修复。毛囊来源的间充质干细胞(h HF-MSCs)可以通过直接拔取毛发的方法获得,不仅来源丰富,而且获取方便。新近研究发现h HF-MSCs可以修复多种受损的组织,如心肌、皮肤和神经等。研究表明干细胞迁移、归巢与其疗效紧密相关。然而h HF-MSCs移植后在体内的迁移、归巢等情况目前未见报道。实验目的:探究h HF-MSCs移植后在小鼠体内的迁移、归巢。实验方法:1.通过直接拔取志愿者毛发的方式获取毛囊,经过蛋白酶消化,分离出h HF-MSCs,采用流式细胞技术检测细胞表面特异性标志物的表达;采用油红O及茜素红S染色分别检测h HF-MSCs成脂、成骨分化能力。2.构建表达荧光素酶和绿色荧光蛋白双报告基因的慢病毒质粒(Luc-e GFP),与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,制备慢病毒颗粒,经过低温超高速离心浓缩后,感染标记h HF-MSCs;利用流式细胞术和细胞化学染色检测Luc-e GFP标记后h HF-MSCs(LG-h HF-MSCs)的表面标志物表达及其成脂和成骨能力;利用分子影像学技术体外检测LG-h HF-MSCs荧光素酶活性,建立细胞数量-酶活性量效曲线。3.将LG-h HF-MSCs通过尾静脉注射到NOD/SCID小鼠体内,监测小鼠体重的改变。利用小动物活体成像技术和PCR检测LG-h HF-MSCs在小鼠体内的分布,HE染色检测LG-h HF-MSCs移植小鼠主要脏器组织结构。利用全自动生化分析仪检测LG-h HF-MSCs移植后小鼠肝功、肾功和心功能改变。实验结果:1.h HF-MSCs的分离、培养及鉴定通过直接拔取志愿者头部毛发,经酶消化法,分离获得h HF-MSCs。镜下可见h HF-MSCs呈长梭样,细胞免疫荧光染色及流式细胞术检测显示,h HF-MSCs表达CD105、CD73、CD44、CD90,不表达CD31、CD34。细胞化学染色显示,在特定的培养条件下,h HF-MSCs具有成脂和成骨分化能力。2.Luc-e GFP标记h HF-MSCs的制备构建含Luc-e GFP双报告基因的慢病毒表达载体,与慢病毒包装质粒(p MDL-g/p,p SRV-rev,p MD2.G)共转染293T细胞,制备慢病毒颗粒,感染h HF-MSCs,制备出Luc-e GFP双报告基因标记的h HF-MSCs的细胞(LG-h HF-MSCs)。镜下观察LG-h HF-MSCs呈长梭形,不仅表达e GFP(表达率在92%以上),还表达CD73、CD44、CD90、CD105,同时具有成脂和成骨分化能力;分子影像学检测结果显示:随着LG-h HF-MSCs细胞数量的增多,荧光素酶活性增强,两者呈显著的正相关(R2=0.99)。3.LG-h HF-MSCs体内移植实验LG-h HF-MSCs经尾静脉注射移植到NOD/SCID小鼠体内,实验期间,小鼠体重逐渐上升、生长状态良好、与正常组及PBS组比无显著差别;分子影像学技术检测发现,LG-h HF-MSCs移植后1、3、7天,BLI信号主要分布在小鼠肺部,且信号强度随着时间推移而逐渐减弱。ALU-PCR检测显示心、肺、脾组织中存在人类特异基因ALU基因表达,且ALU基因随时间推移逐渐减弱;肝组织3天组ALU基因表达最强;肾组织中仅1天组中ALU基因表达;皮肤中ALU基因表达随时间推移逐渐增强;而脑组织中ALU基因无比表达。免疫荧光检测发现LG-h HF-MSCs移植后,迁移归巢到小鼠肺部。HE染色显示LG-h HF-MSCs移植小鼠主要脏器脏组织结构与正常组及PBS组比无显著差别。生化功能检测LG-h HF-MSCs移植小鼠肝功、肾功和心功能与正常组及PBS组比无显著差别。实验结论:h HF-MSCs移植后7天内主要迁移归巢到小鼠肺部组织,小鼠主要脏器组织形态结构和生化功能未见异常。
【关键词】：毛囊 间充质干细胞 荧光素酶报告基因 迁移 归巢
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R457.7
【目录】：

• 前言4-6
• 中文摘要6-8
• Abstract8-13
• 中英文缩略词对照表13-14
• 第一篇 文献综述14-20
• 1. 干细胞移植治疗14-15
• 1.1 胚胎干细胞移植治疗14-15
• 1.2 间充质干细胞移植治疗15
• 2. 毛囊15-17
• 2.1 毛囊的结构15-16
• 2.2 毛囊来源的间充质干细胞16-17
• 3. 干细胞标记示踪技术17-19
• 3.1 放射性核素标记技术17
• 3.2 磁标记技术17-18
• 3.3 荧光标记技术18
• 3.4 生物发光成像技术18-19
• 4. 总结与展望19-20
• 第二篇 实验研究20-43
• 第1章 hHF-MSCs的分离、培养及鉴定20-27
• 1.1 实验材料20-21
• 1.2 实验方法21-24
• 1.3 实验结果24-26
• 1.4 实验小结26-27
• 第2章 Luc-e GFP标记的hHF-MSCs的制备27-34
• 2.1 实验材料27-28
• 2.2 实验方法28-30
• 2.3 实验结果30-33
• 2.4 实验小结33-34
• 第3章 LG-hHF-MSCs体内移植实验34-43
• 3.1 实验材料34-35
• 3.2 实验方法35-37
• 3.3 实验结果37-42
• 3.4 实验小结42-43
• 第三篇 讨论43-47
• 第四篇 结论47-48
• 参考文献48-53
• 作者简介及在校期间所获科研成果53-54
• 致谢54

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