GhPR5K调控棉花抗黄萎病的分子机制

发布时间：2020-04-01 14:56

【摘要】：黄萎病(Verticillium dahliae)是我国乃至世界棉花生产上的重要病害,寄主的抗病机制不清是病害有效控制的瓶颈问题。本文通过对抗病品种和感病品种经黄萎病菌诱导前后根部蛋白的磷酸化分析,获得一个差异显著的类受体蛋白激酶GhPR5K。利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术验证其在棉花抗黄萎病过程中的功能,并进一步分析其防御反应机制,筛选其互作的蛋白。取得的主要结果如下:1.利用黄萎病菌Vd080侵染抗病品种中植棉2号和感病品种冀棉11号,进行修饰蛋白质组定量分析,共检测到1716个磷酸化蛋白,其中639个显著差异的蛋白,主要涉及到植物激素信号转导途径、MAPK信号通路、AMPK信号通路、植物病原互作及mTOR信号通路等。其中,Gh_D04G1868在中植棉2号处理组与对照组间的差异倍数最高,达到了12.69,而在冀棉11号处理组与对照组间的差异不显著。同源性比较发现Gh_D04G1868与拟南芥的病程相关蛋白激酶AtPR5K相似性达到了84.7%,因此将其命名为GhPR5K。进一步分析发现,接种Vd080后,GhPR5K在中植棉2号中的表达量大幅度提高,初步推断GhPR5K参与了棉花对黄萎病的防御反应。2.基因克隆得到了GhPR5K全长。其CDS全长1887bp,编码628个氨基酸,位于Dt_chr12染色体上。蛋白序列分析表明,在252-274碱基区内有一个跨膜区,N端有一个信号肽,C端有一段丝氨酸/苏氨酸富集区域。3.利用VIGS技术,成功地在棉花中沉默该基因。接种试验表明,沉默植株叶片大量变黄、萎蔫,甚至脱落、枯死;而对照植株叶片变黄、萎蔫明显较轻,没有严重的脱落和枯死植株。接种后20d和25d,TRV:GhPR5K的病情指数分别为19.5和54.2,显著高于对照植株的10.3和25.2,表明GhPR5K正调控棉花对黄萎病的抗性。进一步遗传转化烟草,获得在选择性培养基上表现为阳性的烟草植株12株。4.将TRV:00和TRV:GhPR5植株接种Vd080,观察其防御反应,分析防御相关基因的表达量。结果表明,与TRV:00植株相比,TRV:GhPR5K植株叶片中活性氧爆发减少、死细胞数较多,茎部木质化程度减弱,茎部定殖有更多的棉花黄萎病菌,维管束褐变程度显著加重。qRT-PCR分析表明,与TRV:00相比,PR基因在TRV:GhPR5K植株均显著下降,4CL、CHI、PAL、POD、CAD、C4H1最高分别下降70.95%、43.57%、55.33%、43.47%、78.09%和71.89%。表明TRV:GhPR5K植株对黄萎病的防御反应明显减弱。5.通过酵母双杂交实验筛选出GhPR5K的互作蛋白DNA J,生物信息学分析表明,该蛋白N段有一个22个氨基酸长度的信号肽、一个跨膜结构、C段有一个蛋白激酶结构域,预测该结构域可能是为GhPR5K蛋白互作的主要结构域。上述研究部分明确了GhPR5K抗黄萎病的分子机制,获得的GhPR5K超表达转基因烟草及互作蛋白仍需要进一步的检测、验证和分析。
【图文】：

模式图,受体蛋白激酶,模式图

中国农业科学院硕士学位论文第一章引言2图1.1 植物类受体蛋白激酶模式图Figure 1.1 Model of plant receptor-like protein kinases1.2 类受体蛋白诱导植物抗病的作用机理1.2.1 类受体蛋白激酶的磷酸化反应和抗病防御反应蛋白质的磷酸化是信号传递过程中的重要化学反应之一，经胞内激酶域在蛋白质的氨基酸羟基侧链上转入ATP的λ位磷酸基团来完成的(Smith et al.,1996)。虽然编码不同抗性的蛋白的RLKs各不相同,但其在抗病过程中都有以下三个过程:①胞外结构域与配体识别并结合；②通过磷酸化等化学反应传递信号；③下游靶蛋白被激活诱导植株产生抗性(Park et al.,2008)。研究发现,只有将RLKs磷酸化后形成复合体，才能调控下游的靶标(Wang et al.,2006; Jeong et al.,1999)。病原信号分子经植物细胞外的受体识别后，植物发生抗病防御反应，诱导植物的系统获得抗性(systemic acquired resistance,SAR)及过敏反应( hypersensitive response,HR)(Gozzo et al.,2003)。病原信号分子在与受体识别后激活了植物的抗病信号通路，诱发HR，致使植物发病部位发生程序性细胞死亡( programmed cell death, PCD)(石军等,2006)。此过程可迅速阻断病原菌扩散，引起活性氧爆发( ractive oxygen species,ROS)，从而杀灭侵入的病原菌(张林青等

示意图,防御反应,示意图,蛋白质磷酸化

图 1.2 RLKs 抗病防御反应示意图Fig 1.2 The schematic representation of RLKs resistance to pathogens and defense responses1.3 植物磷酸化蛋白质组研究现状蛋白质磷酸化是蛋白质修饰研究中最深入的领域之一，在调控信号转导过程中发挥了重要作用。磷酸化酶和激酶网络的精确调控可通过磷酸化修饰来完成，进而调控细胞增殖、生长及胞内外生物刺激反应等(甄艳等,2014)。蛋白质磷酸化包括蛋白质磷酸化和去磷酸化修饰(Peck etal.,2003;Khan et al.,2005;Chou et al.,1999; Chou et al.,2004;Hubbard et al.,1993)。磷酸化是指在蛋白激酶的催化作用下供体磷酸基团转移到受体蛋白质的氨基酸残基上的过程。去磷酸化是在磷酸化酶的催化作用下完成的(图 1.3)。蛋白质磷酸化在真核生物中主要发生在苏氨酸、丝氨酸和酪氨酸残基上；天冬氨酸、谷氨酸和组氨酸则更容易在原核生物中发生磷酸化(姜铮等,2009;张倩等,2006)。蛋白质磷酸化不仅参与酶促反应，还能介导蛋白活性(梁前进等,2012)，，在参与调节生物体内的细胞发育、细胞变异与转化、蛋白激酶的激活等过程中也发挥着重要作用(Hunter etal.,2000;Wan et al.,2008)。细胞中蛋白质磷酸化中的细微差异都可能导致细胞代谢水平上的变化(张倩等,2006)。因此，蛋白质磷酸化对植物生长发育的影响是全方位的。目前为止，蛋白质的可逆磷酸化是已知生物体内最主要的信号传递方式(Yang et al.,1997)。一些研究预测真核生物细胞磷
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S435.62

【参考文献】