桑椹花青素合成相关miRNAs的鉴定及其功能研究

发布时间：2020-04-07 15:58

【摘要】：桑椹花青素是一种天然水溶性色素,其生物合成途径涉及众多结构基因和调节基因的参与。植物miRNAs作为一类重要的调控因子,在花青素生物合成途径中起着重要的调控作用。本研究以不同发育时期的桑椹为试验材料,利用基于Illumina高通量测序的小RNA数字化分析技术,分析了不同发育时期桑椹中miRNAs表达谱的变化,鉴定出了参与桑椹花青素合成相关的miRNAs,并通过psRNATarget软件预测了差异表达mi RNAs的靶基因;利用转基因和qRT-PCR技术研究了mul-miR159a和mul-mi R477及其靶基因在花青素生物合成过程中的调控作用,为全面揭示桑椹花青素合成的分子机制奠定了基础,同时也为桑树遗传改良提供了候选基因,对于促进桑树功能基因组学研究具有重要意义。本文的主要研究结果如下:(1)不同发育时期桑椹中花青素的检测通过pH示差法测定了不同发育时期桑椹总花色苷的含量,并采用HPLC技术对桑椹花青素进行了定性与定量分析,结果表明:桑椹花青素主要有矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和矢车菊素-3-O-芸香糖苷两种花色苷组成,桑椹由青转红变紫过程中,两种花色苷含量逐渐升高。(2)桑椹小RNA高通量测序文库的构建及测序分析构建了不同发育时期的桑椹小RNA测序文库并进行了测序分析,在不同发育时期的桑椹中共鉴定了51个家族的139个保守的miRNAs,预测到42个新miRNAs,发现了76个差异表达miRNAs,并预测到124个靶基因,差异表达miRNAs的靶基因大多为调控植物次生代谢生物合成的转录因子。(3)mul-miR159a及其靶基因Mul-MYB33对花青素合成的调控作用分析利用PCR技术克隆获得Mul-MIR159a基因及其靶基因Mul-MYB33,分别构建了其植物表达载体,并侵染拟南芥获得转基因植株。荧光定量PCR分析发现Mul-MIR159a在拟南芥中成功表达,并能加工成mul-miR159a成熟体,生成的mul-miR159a可以靶向拟南芥中Mul-MYB33的同源基因Ath-MYB33,而Mul-MYB33基因在拟南芥中超表达使转基因拟南芥植株中花青素的积累量增加。因此,mul-miR159a可以通过靶向Mul-MYB33基因在花青素的生物合成过程中起到负调控作用。(4)Mul-MIR159a和Mul-MYB33基因启动子的克隆及其表达活性分析利用PCR技术分别克隆得到Mul-MIR159a基因启动子(pMulMIR159a)和Mul-MYB33基因启动子(pMulMYB33),并成功构建了两个启动子的植物表达载体。通过PlantCARE在线软件分析,发现两个启动子核苷酸序列中均含有TATA、CAAT-Box启动子核心元件,和光照、激素、低温等响应元件及MYB结合位点,表明这两个启动子可能具有复杂的诱导表达活性。利用农杆菌介导的烟草瞬时侵染表达系统,结合GUS组织化学染色证明了pMulMIR159a和pMulMYB33都具有光照和GA诱导表达活性;Mul-MIR159a和Mul-MYB33基因具有光照和GA诱导表达特性。(5)mul-miR477—MuL-ABCB19-AS—Mul-ABCB19级联途径对花青素合成的调控作用分析利用PCR技术克隆获得Mul-MIR477、Mul-ABCB19-AS、Mul-ABCB19基因,分别构建了其植物表达载体,并通过转基因和杂交技术在拟南芥中建立了mul-miR477—Mul-ABCB19-AS—Mul-ABCB19级联途径。证明了mul-miR477对Mul-ABCB19-AS基因的靶向切割作用以及Mul-ABCB19-AS对Mul-ABCB19基因表达的抑制作用。发现Mul-ABCB19基因在拟南芥中表达可以提高转基因植株中花青素的积累量,而mul-miR477可以通过mul-miR477—Mul-ABCB19-AS—Mul-ABCB19级联途径正调控花青素的合成。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S888.2

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