基于磁珠-SELEX技术的新型有机磷农药OP3的适配体筛选

发布时间：2020-04-08 20:13

【摘要】：有机磷农药因药效好、种类多等优点,已被广泛用于我国农业生产,是目前使用量最广的一类农药。但随着生产力的提高,有机磷农药的乱用、滥用等情况越来越严重,导致食品和环境中有机磷农药残留量超标,对人类健康造成了威胁,甚至出现多起有机磷农药中毒事件,故迫切需要开发新技术以实现快速、灵敏检测食品和环境中的有机磷农药残留。适配体因具有高亲和性、成本低廉、靶标范围广泛和易于化学修饰等特点,在有机磷农药残留的检测方面有着巨大的应用潜能。因此有必要筛选得可识别多种有机磷农药的的适配体,为今后建立一种基于适配体的快速、灵敏检测有机磷农药残留的方法奠定基础。本研究基于磁珠-SELEX技术,筛选得到有机磷农药OP3的适配体,并对其性质进行了考察。主要工作如下:1、选择课题组自主合成的有机磷农药OP3和OP4作为候选靶标,将OP3和OP4分别和载体蛋白BSA、OVA偶联,得到四种偶联产物OP3-BSA、OP3-OVA、OP4-BSA、OP4-OVA,以紫外光谱法初步判断偶联是否成功,随后用生物质谱法计算并比较四种偶联产物的偶联比。发现OP3-BSA的偶联比最高,更有利于筛选,因此选择OP3作为靶标进行筛选。2、通过碳二亚胺法将偶联比最高的OP3-BSA固定在氨基磁珠上用于正筛选,将BSA固定在氨基磁珠上用于反筛选。将OP3-BSA-Beads和初级单链DNA(ssDNA)文库混合,于室温下反应45 min,随后用结合缓冲液洗去未结合的ssDNA。用洗脱缓冲液在95 ℃条件下将结合到OP3-BSA-Beads上的ssDNA洗脱。将洗脱下来的ssDNA进行PCR扩增,随后将扩增后的双链DNA(dsDNA)解链成ssDNA,并制成次级文库用于下一轮筛选。筛选共进行19轮,并利用BSA作为负靶标,进行了六轮反筛选,以除去与BSA具有亲和性的ssDNA。通过测定每轮文库中与OP3具有亲和性的ssDNA的富集情况,选出第14轮的文库进行高通量测序,并用mfold软件对测序丰度大于30的序列进行二级结构模拟,经过分析比较,得到共16条适配体序列。3、对这16条序列的亲和性进行初步表征,选出亲和性最高的4条适配体PES11、PES19、PES20、PES21进行解离常数(Kd)的测定。它们的 Kd 值分别为 276±13.4nM、28.99±4.57nM、28.85±3.3OnM、45.30±4.24 nM,说明这四条适配体都对OP3具有很高的亲和性。4、评价了这四条适配体对OP3、倍硫磷、对硫磷、甲基对硫磷、杀螟松、丰索磷、辛硫磷的结合能力,发现它们均能与至少两种农药结合,其中PES11能与上述七种农药结合,对农药的识别范围最广。
【图文】：

流程图,流程图,寡核苷酸,文库

经过多轮以上筛选程序，即可得到对靶标具有高亲和性的核酸适配体。逡逑１．３．２逦ＳＥＬＥＸ邋的过程逡逑ＳＥＬＥＸ技术的基本流程图如图１－１所示。步骤如下：（１）通过分子生物学原理逡逑在体外化学合成库容量为１0１３－１0１５的随机寡核苷酸文库［５３］，文库的寡核苷酸序列一般逡逑由位于两端的固定序列和位于中间的随机序列组成，其中固定序列的作用是作为ＰＣＲ逡逑扩增阶段引物的结合位点，随机序列的作用是提供文库的随机性和多样性，随机序列逡逑一般含２０－６０个碱基。（２）在特定的缓冲体系下，将寡核苷酸文库与靶标进行孵育。逡逑（３）通过特定的分离方法，如洗涤等，将寡核苷酸－靶标复合物与未结合／微弱结合的逡逑寡核苷酸分开。（４）通过特定的分离方法，如高温洗脱等，将寡核苷酸从寡核苷酸－靶逡逑标复合物中分离。（５）将分离的寡核苷酸进行ＰＣＲ扩增，以达到对特异性寡核苷酸进逡逑行富集的目的。（６）将扩增后的双链ＤＮＡ产物再次制成单链ＤＮＡ

紫外扫描,图谱,载体蛋白,偶联

Ｆｉｇ．２－１邋ＵＶ邋Ｓｃａｎｎｉｎｇ邋Ｓｐｅｃｔｒａ邋ｏｆ邋ＯＰ３，，邋ＢＳＡ邋ａｎｄ邋ＯＰ３－ＢＳＡ逡逑注：１邋为邋ＯＰ３邋，邋２邋为邋ＢＳＡ邋，邋３邋为邋ＯＰ３－ＢＳＡ逡逑如图２－１所示，偶联产物ＯＰ３－ＢＳＡ的紫外吸收曲线与其相应的载体蛋白ＢＳＡ及逡逑有机磷农药ＯＰ３具有明显差异，且兼具两者的特征吸收峰。根据该现象，可初步判断逡逑ＯＰ３与载体蛋白ＢＳＡ偶联成功。逡逑１６逡逑
【学位授予单位】：北京化工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ450.1

【参考文献】