南方根结线虫二龄幼虫根外存活机制

发布时间：2020-04-10 23:21

【摘要】：植物病原线虫引起的农作物线虫病害造成的损失已超过细菌病害、病毒病害造成的损失,成为仅次于真菌病害的第二大病害。在常见的植物寄生线虫中,南方根结线虫分布最为广泛,引起的危害也最为严重,已成为世界农业可持续发展的制约因素。由于南方根结线虫的寄主广泛性和内寄生特性,目前依然缺乏高效、安全的防控方法。南方根结线虫卵孵化后成为二龄幼虫(second-stage juveniles,J2),在侵染植物前需要克服许多逆境,其中饥饿是最大的逆境之一。因此,从分子层面解析二龄幼虫根外存活机制是建立高效防控措施的关键和基础。目前,对J2幼虫如何度过饥饿的分子机制知之甚少。以前的研究发现,根结线虫二龄幼虫在缺乏宿主植物的情况下,根外存活时长延伸,脂肪含量逐渐减少。但是,脂肪水解是否参与二龄幼虫抵抗饥饿还不清楚。基于南方根结线虫基因组信息,本研究选取根外存活不同时期的三组(即Fresh,Middle和Last)二龄幼虫分别进行RNA-seq高通量测序,发现差异表达基因主要富集到脂肪代谢和溶酶体途径等相关代谢途径。脂肪和溶酶体特异性染色及超微结构分析,进一步证实RNA-seq的分析结果。借助于RNA干扰技术和药物抑制,本研究确定“花生四烯酸-溶酶体-脂肪”信号通路调控二龄幼虫对饥胁迫的耐受,为南方根结线虫防控措施的研发奠定理论基础。主要研究结果如下:1.RNA-seq测序分析结果显示,短期饥饿胁迫诱导的差异表达基因为1852个,其中952个为上调差异表达基因;长期饥饿胁迫诱导的差异表达基因为1930个,其中862个为上调的差异表达基因,长、短期饥饿胁迫诱导的共有差异表达基因为1124个。差异表达基因的GO和KEGG富集分析表明,上调的差异表达基因主要参与脂肪代谢、氨基酸分解、酮体的生成与分解和溶酶体等相关途径;而下调的差异表达基因主要参与糖代谢和物质的跨膜转运。富集到脂肪代谢的上调表达差异基因主要为脂酶基因(atgl-1),脂肪酸β氧化基因(acox-1),脂肪酸去饱和酶基因(fat-6,fat-3)以及参与脂代谢调控的hnf-4和ppar同源基因,而参与溶酶体途径的主要是组织蛋白酶基因、糖苷酶基因和脂酶基因,说明二龄幼虫根外存活期间,脂肪代谢和溶酶体生物发生显著增强。2.饥饿胁迫促进根结线虫转录因子Mi-hlh-30表达上调。经Mi-hlh-30_dsRNA处理后,Mi-lipl-1表达量降低。同时,二龄幼虫溶酶体的生物发生显著受到抑制,根外存活时间明显缩短,脂肪降解明显受到抑制,二龄幼虫的运动能力明显降低,表明Mi-hlh-30调控溶酶体的生物发生和脂肪的水解。3.饥饿胁迫增加花生四烯酸的相对含量,参与花生四烯酸生成的脂肪酸去饱和酶基因Mi-fat-6和Mif-t-3分别被干扰后,Mi-hlh-30表达受到抑制,溶酶体产生显著受到限制,根外存活的时间明显缩短,脂肪水解减弱,运动能力显著降低。添加下游产物花生四烯酸可恢复Mi-fat-6和Mi-fat-3分别沉默引起的表型缺陷,却不能恢复Mi-hlh-30沉默引起的,进一步说明Mifat-6和Mifat-3通过调节花生四烯酸的合成促进Mi-hlh-30的表达,进而调控溶酶体的生物发生。4.溶酶体特异性抑制剂(氯喹、氯化铵和Baf-Al)分别处理二龄幼虫后,二龄幼虫的表型缺陷与Mifat-6、Mifat-3和Mi-hlh-30分别被干扰后的类似,进一步证实溶酶体介导的脂肪水解对二龄幼虫根外存活的重要性。5.Mi-RAB7介导二龄幼虫根外存活期间脂肪的水解,Mi-Rab7的沉默抑制脂肪水解和缩短根外存活时间。综上所述:1.首次证实溶酶体参与二龄幼虫根外存活期间脂肪的水解。2.证实饥饿胁迫促进Mifat-6,Mi f-t-3的表达,通过花生四烯酸的介导,促进Mi-hlh-30显著表达,进而增强溶酶体产生,促进脂肪降解。
【图文】：

育较为成熟的卵和卵中的幼虫其对根结线虫卵粒的侵染主要包括附着、穿逡逑刺和定殖三个过程。首先，当遇到根结线虫卵粒时，厚垣孢普可尼亚菌产生大量逡逑的糖蛋白，以帮助分生孢子和菌丝粘住卵粒表面（图１．２）逦其次，为穿过卵壳，逡逑厚垣孢普可尼亚菌的萌发管和菌丝顶端分化产生附着孢（图１．３）邋１＂２１，并分泌胞外逡逑酶，然而，附着孢如何穿刺卵壳依然来知｜ｍ１。最后，为获取营养并增加其繁殖能逡逑力，厚垣孢普可尼亚菌吸取卵中的糖类（二糖）作为碳源物质。根结线虫的卵壳逡逑主要由三层构成（图丨．４），即最外侧富含各类蛋白的卵黄膜、中间层的几丁质层和逡逑内侧的脂质层【｜｜４〗。厚垣孢普可尼亚菌能有效侵染根结线虫的卵粒，许多胞外酶类逡逑物质自然起到关键作用。Ｌｏｐｅｚ－Ｌｌｏｒｃａ等首先从厚垣孢普可尼亚菌中分离到并纯化逡逑出丝氨酸蛋白酶Ｐ３２，其分子量为３２ｋＤａｌ｜ｌ５ｌ，随后，Ｌｏｐｅｚ－Ｌｌｏｒｃａ等将纯化后的丝逡逑l#酸蛋白酶Ｐ３２处理甜菜孢囊线虫（Ｚ／ｅ／ｅｒａｉ／ｅｒａ．ｖｃ／ｗｃ／７／／７）卵粒，，与对照相比，丝逡逑氨酸蛋白酶Ｐ３２处理的卵粒

逦逦邋ＬＩＰＩＤ邋ＬＡＹＥＲ逡逑图１．４：植物寄生线虫卵壳截面示意图。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．４：邋Ｄｉａｇｒａｍｍａｔｉｃ邋ｒｅｃｏｎｓｔｉ邋ｕｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ａ邋ｃｒｏｓｓ邋ｓｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｅｇｇ邋ｓｈｅｌｌ邋ｏｆ逡逑ｐｌａｎｔ－ｐａｒａｓｉｔｉｃ邋ｎｅｍａｔｏｄｅｓ．逡逑图片米源于：Ｂｉ丨？0！邋ａｎｄ邋Ｂｉｒｄ．邋７＞ｙ／／７似ｃ／／ｏ似逦（邋１９９１）逡逑淡紫色拟青霉（ＰＭＣ／７0ｍ＞Ｗ５邋／／／ａｃ／Ｍ．ｖ）是一种分布广泛且常用来防控根结线逡逑虫的兼性生防真菌，Ｌｙｓｅｋ等最初发现淡紫色拟青霉常与线虫卵共生１１２５１，随后，逡逑Ｊａｔａｌａ等在秘鲁发现淡紫色拟以褐南方根结线虫不是讳生关系，而是寄生于南方逡逑根结线虫的卵粒１｜２？１２７】。与厚垣孢普可尼亚菌一样，淡紫色拟青霉主要是植物寄生逡逑线虫的卵，并且其对植物寄生虫卵的侵染模式也主要包括三个过程，即附着、穿逡逑刺和定殖。同样地，在淡紫色拟青霉侵染植物寄生线虫卵的过程中，几丁质酶和逡逑丝氨酸蛋白酶也扮演着重要的作用［１２８］。在研宄花生根结线虫的过程中，逡逑Ｍ邋0邋ｒｇａ邋ｎ邋－．丨0邋ｎ邋ｅ邋ｓ等将线虫卵粒．１邋ｊ淡紫色■拟宵搏侵染共廔＃后，线虫卵壳的超微结构出逡逑现明显的变化：卵黄层分裂成三个厚度不一的模块
【学位授予单位】：云南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S432.45

【参考文献】

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3 赵鸿,彭德良,朱建兰;根结线虫的研究现状[J];植物保护;2003年06期

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本文编号：2622830