广西苦瓜白粉病菌生理小种鉴定与抗白粉病SNP分子标记的开发

发布时间：2020-04-12 17:16

【摘要】：苦瓜白粉病是危害苦瓜生产的重要病害,其防治的最有效措施就是抗病品种的选育和利用,但苦瓜白粉病生理小种鉴定和分子标记辅助育种等基础研究还存在着许多不足。本试验对供试苦瓜白粉病病菌分别采用国际通用的13个甜瓜鉴别寄主和6个苦瓜专用型鉴别寄主,两套体系进行鉴定,并对白粉病菌接种及菌株保存方法进行了研究。单核苷酸多态性(SNP)被认为是最有发展潜力的第三代分子标记,本研究利用SLAF-seq(Specific-Locus Amplified Fragment Sequencing)技术,以高抗白粉病自交系MC18和高感白粉病自交系MC105及其通过抗感鉴定的杂交F:代叶片DNA为材料,对苦瓜遗传分离群体(2个亲本和30+30的混池)进行关联分析,筛选到29个与目标性状相关联的候选位点。而后利用测序得到的序列,采用四引物扩增受阻突变体系PCR(Tetra-primer ARMS PCR)特异性扩增的方法和酶切扩增多态性序列(CAPS)酶切的方法,开发实用的SNP标记,并对其反应条件进行优化与验证。主要实验结果如下:1.通过两套鉴别体系进行比对鉴定,初步确定广西地区苦瓜白粉病的优势生理小种为S.fuliginea的生理小种1和生理小种M-4。分别用白粉孢子接种法、贴病叶法和悬浮孢子喷液法将该白粉病病原接种于寄主叶片上,观察不同接种方法对白粉病发病的影响,结果显示:白粉孢子接种法发病早且重;贴病叶法其次,病斑集中产生于贴叶处;悬液法虽发病稍晚,但发病均匀且易于鉴定。2.利用 SLAF-seq(Specific-Locus Amplified Fragment Sequencing)技术对苦瓜遗传分离群体(2个亲本和30+30的混池)进行关联分析,共获得多态性SLAF标签5502个,多态性标签的比例为5.99%。对多态性SLAF标签进行关联性分析,筛选到29个与目标性状相关联的Marker。3.利用筛选得到的29个与目标性状相关联的Marker,用在线引物设计软件http://primerl.soton.ac.uk/primrl.html进行引物设计,共设计了 46组引物。经过对扩增条件和扩增体系的优化,得出最优Tetra-primer AMRS PCR的反应条件为。利用优化好的体系来对Tetra-primer AMRS PCR引物组进行筛选,筛选获得3组在父母本及F2代检测到多态性的Tetra-primer AMRS PCR分子标记引物,分型结果稳定,重复性好。4.利用测序得到的序列,使用在线酶切位点识别软件http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html在含有关联 Marker 的候选SNP序列中筛选存在CAPS突变的位点,挑选出合适的内切酶,然后利用引物设计软件Primer5.0设计CAPS引物。利用优化好的体系最后筛选出Marker8515具有酶切扩增多态性,且分型结果稳定,可作为CAPS标记。
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广西大学硕士学位论文逦广西苦瓜白粉病菌生理小种鉴定与抗白粉病ＳＮＰ分子标记的开发逡逑具体操作为：取病叶上的分生孢子，用解剖针挑到于载玻片上，用３％的ＫＯＨ作逡逑延展剂，盖上盖玻片，在１０Ｘ４０倍的光学显微镜下观察分生孢子上是否有纤维状体，逡逑有纤维状体的是逦（邋Ｖａｋａｌｏｕｎａｋｉｓ邋ｅｔ邋ａｌ，邋１９９４）邋0逡逑表１－２两种主要瓜类白粉菌的形态特征逡逑Ｔａｂｌｅ邋１－２邋Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ邋ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ邋ｏｆ邋ｔｗｏ邋ｍａｉｎ邋ｔｙｐｅｓ邋ｏｆ邋Ｅｒｙｓｉｐｈｅ逡逑白粉菌种类逦子囊壳（ｕｍ）逦子囊和子囊孢子逦分生孢子类型逦分生孢子的萌发逡逑逦个数（个）逦方式逡逑Ｅ．ｃｉｃｌｗｒａｃｅａｒｕｍ逦生于灰黄色至逦一般子囊数逦细长的圆柱形，萌发管指状，从逡逑锈褐色菌丝层逦１０￣１５逦分生孢子上没有分生孢子的顶端逡逑直径８０？１４０逦子囊孢子数２逦纤维状体逦或底部长出逡逑Ｓ．ｆｕｌｉｇｉｎｅａ逦生于白色至淡逦子囊数１逦椭圆形，分生孢萌发管叉状或顶逡逑黄色菌丝表面逦子囊孢子数８逦子上有发达的纤端膨胀，从分生逡逑逦直径６５￣９８逦维状体逦孢子的侧面长出逡逑ａｂ逡逑

序列的接头后，对测序质量和数据量进行评估。可以通过Ｃｏｎｔｒｏｌ数据评估酶切效率，逡逑以此判断实验过程的准确性和有效性。通过序列间聚类的方法，，在亲本和混池中开发逡逑ＳＬＡＦ标签，寻找在亲本中存在多态性的ＳＬＡＦ标签。具体测序分析流程如图３－２；逡逑．…＇邋．邋．逡逑ｍｍ－ｒｍ邋Ｌ——ｉｌＭＨＨ逦Ｊ邋Ｈａａ？邋Ｉ逡逑灄音？＿逦ＬＪ邋ｍｔｍｍ逡逑＇逡逑恀：）：~T饕逡逑R莼�逡逑图３－２测序分析流程逡逑２４逡�

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