OsF3HO3g和OsF3HO4g在水稻与细菌性条斑病菌互作中的功能研究

发布时间：2020-04-19 19:03

【摘要】：水稻是世界范围内的粮食作物,而病原菌的侵害是水稻种植过程中的主要制约因素。水稻细菌性条斑病(bacterial leaf streak,BLS)简称条斑病是由稻黄单胞菌稻生致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)引起的细菌性病害,该病害逐渐成为非洲西部、中国南方和中部的主要病害。目前尚无携带条斑病主效抗病基因的水稻栽培品种,因而探究条斑病菌中的致病因子与水稻之间的互作,对于挖掘潜在的抗病基因以培育抗病品种具有重要的指导意义。本研究从湖北省黄冈市水稻种植区分离得到一个Xoc小种并命名为HGA4,为了验证该小种的致病性,以Xoc模式小种RS105作为对照,通过在8个粳稻品种和6个籼稻品种水稻上进行致病力鉴定,结果显示HGA4的致病力比RS105更强。为了进一步阐述HGA4的强致病力机制,本研究利用三代测序技术对HGA4的基因组进行测序以寻找可能的致病因子。转录激活类效应因子(transcription activator-like effectors,TALEs)是Xoc的主要致病因子,因而本研究根据HGA4基因组测序数据分析了HGA4基因组中所有的TALEs,发现HGA4中包含28个TALEs,这28个TALEs当中的24个在已经测序分析的RS105基因组中均有相应的同源物;而且RS105中仅有24个TALEs,而HGA4基因组中另外的四个TALEs分别为Tal2b、Tal2c、Tal2d和Tal2e。同源性分析显示,HGA4中的Tal2b与国外Xoc模式小种BLS256中的Tal2c同源,而前人研究显示BLS256中的Tal2c可能靶定水稻中编码2-酮戊二酸和亚铁离子依赖型氧化酶(2-oxoglutarate and Fe(II)-dependent dioxygenase,2OGD)的基因OsF3H03g。进一步的接种诱导表达分析显示,接种RS105过程中OsF3H03g基因的表达量没有显著变化,而接种HGA4过程中OsF3H03g基因被显著诱导表达。为了验证Tal2b是否直接靶定OsF3H03g基因,本研究从HGA4基因组中克隆到Tal2b基因,并利用烟草瞬时表达以及凝胶迁移率实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)证明了Tal2b直接结合OsF3H03g基因启动子并促进基因表达。同时,将HGA4中的Tal2b转入RS105后发现,RS105/Tal2b可以显著诱导OsF3H03g基因的表达,而且RS105/Tal2b在水稻叶片上造成的病斑长度显著长于RS105,说明Tal2b作为Xoc中的毒性因子促进在水稻中的侵染。为了验证OsF3H03g基因在水稻与Xoc互作中的作用,本研究在中花11(ZH11)水稻中进行遗传转化获得OsF3H03g超量表达和抑制表达转基因水稻以及基因编辑水稻。进一步的抗性鉴定显示,OsF3H03g超量表达转基因水稻对条斑病更加敏感,而抑制表达转基因水稻和基因编辑水稻则提高对条斑病的抗性,说明OsF3H03g负调控水稻对条斑病的抗性。为了解析OsF3H03g如何参与水稻和Xoc的互作,通过酵母双杂交筛选到与OsF3H03g发生互作的一个编码尿苷二磷酸糖基转移酶(uridine diphosphate-glycosyltransferase,UGT)的蛋白OsUGT。进一步利用蛋白下拉实验(Pull-down assay)和双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)实验验证了OsF3H03g与OsUGT互作的真实性。同时,在ZH11水稻中对OsUGT基因进行超量表达和抑制表达以及基因编辑修饰操作,结果显示超量表达OsUGT基因增加水稻对条斑病的感病性而抑制表达和基因编辑则提高水稻对条斑病的抗性,说明OsUGT同样作为负调控因子参与水稻对条斑病的抗性。此外,在OsF3H03g和OsUGT抑制表达转基因株系中,水杨酸(salicylic acid,SA)信号路径基因被激活,暗示OsF3H03g和OsUGT作用的信号路径与SA相关。另一方面,本研究发现HGA4中的Tal2c与BLS256中的Tal2d同源,而研究显示BLS256中的Tal2d可能靶定水稻中另外一个编码2OGD的基因OsF3H04g。接种表达模式分析显示,RS105不能诱导OsF3H04g基因的表达而HGA4则可以显著诱导该基因的表达。为了验证OsF3H04g基因是否参与调控水稻与Xoc的互作,通过遗传转化获得OsF3H04g超量表达转基因水稻并从韩国水稻突变体库获得插入突变体水稻osf3h04g。抗性鉴定结果显示,OsF3H04g超量表达转基因水稻对条斑病的感病性增加,但是,OsF3H04g插入失活突变体水稻osf3h04g也表现对条斑病的感病性增加,暗示着该基因在调控水稻和Xoc互作过程中的功能具有特殊性。为了揭示osf3h04g水稻的感病性机制,对其进行转录组学分析发现,osf3h04g中的抗病相关基因以及SA和茉莉酸(jasmonic acid,JA)信号相关基因下调表达。进一步的激素测定显示,osf3h04g中JA含量降低而且与JA合成相关的基因OsLOX9和OsAOS2在osf3h04g中下调表达;另外,osf3h04g中SA大幅降低但与SA合成相关的基因OsPAL和OsICS并没有显著变化。有趣的是,在osf3h04g转录组数据中一个同样编码2OGD的基因OsS3H呈现大幅的上调表达。进一步在水稻中对OsS3H基因进行超量表达和基因编辑修饰突变并得到相应的转基因植株,结果显示,超量表达OsS3H促使水稻对条斑病的感病性增加而基因编辑修饰则增强水稻对条斑病的抗病性。以上结果暗示着OsF3H04g基因突变后导致OsS3H基因的表达量提高从而促使感病。综上所述,本研究揭示了2OGD基因OsF3H03g和OsF3H04g调控水稻对条斑病的感病机制,这项研究将有利于培育抗条斑病水稻品种。
【图文】：

如图1 所示病原菌通过 T3SS 将自身的效应因子（type III secretion system effector, T3SE）注入寄主植物中干扰抗病反应以促进侵染定殖（Buttern and He, 2009）。三型分泌系统分泌的效应因子分为转录激活类效应因子（transcription activator-like effector, TALE）和非转录激活类效应因子（Non-TALE），TALEs 可以作为转录因子进入寄主细胞核启动宿主基因的表达，而 Non-TALEs 一般通过酶活作用干扰寄主细胞的生物学过程（White et al., 2009）。图 1 三型分泌系统作用模式 (Buttner and He, 2009)Fig. 1 The type III secretion system work model (Buttner and He, 2009)1.1.2.1 稻黄单胞菌三型分泌系统水稻和黄单胞菌之间的互作作为寄主与病原物互作模式受到广泛的关注(Ni o-Liuet al., 2006)，大量的稻黄单胞菌 T3SEs 与寄主水稻的相互作用被鉴定。稻黄单胞菌中的三型分泌系统由 Hrp 基因簇编码，在 Xoc 小种 RS105 基因组中包含有 10 个 Hrp 基因、9 个 Hrc 基因、8 个 Hpa 基因，其中 HrpF 基因突变会影响 RS105 在烟草上激发的细胞超敏反应（hypersentivite response, HR）以及在成株期水稻上的致病力（Zou et al.,2006）；而 Hpa2 和 HrpF 相互作用参与调控 RS105 中的 TALEs 向水稻?

图 2 TALEs特异性靶定 DNA 模型 (Boch et al., 2009)Fig. 2 Model for special DNA-targets of TALEs (Boch et al., 2009)在数量众多的 TALEs，Xoc 中包含有 19-27 个 TA异(Wilkins et al., 2015)；而 Xoo 中同样包含数量可种存在较大差异，在亚洲变种中有 15-26 个 TALE北美变种不包含任何 TALEs (Gonzalez et al., 2007, 2016；Erkes et al., 2017) 。目前，Xoc 中鉴定的 T（Cernadas et al., 2014；Read et al., 2016；Hummel Xoo 中已经鉴定的 TALEs 包括 AvrXa5、AvrX、PthXo1、PthXo2、PthXo3、PthXo6 和 PthXo7(Zo；Gu et al., 2005；Wang et al., 2014a；Yang et al., 2
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S435.111.4

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