蜡蚧菌对甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的抗性改良及效果评价

发布时间：2020-04-20 19:18

【摘要】：蜡蚧菌(Lecanicillium lecanii)是一种优良的虫生真菌,对农业病虫害具有很好的防治效果。然而,蜡蚧菌在应用时为活菌制剂,杀真菌剂对其有致命的影响,在田间不能与杀菌剂等化学药剂同时施用。针对蜡蚧菌对杀菌剂敏感的问题,有必要对蜡蚧菌进行菌株改良而用于生物防治。本研究筛选对甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂具有高抗性的真菌菌株,克隆其抗性基因,利用其抗药性基因转化蜡蚧菌的敏感菌株,筛选获得抗性较强的转化子,为蜡蚧菌的田间应用提供基础。研究已取得了如下结果。1.筛选对甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂具高抗性的真菌菌株。从分离纯化的多类植物病原菌中,应用孢子萌发法,筛选对醚菌酯药剂表现出高抗药性水平的菌株F-2。F-2菌株对醚菌酯的EC_(50)值大于2500μg/ml(田间常用浓度为250μg/ml)。菌株经ITS序列测序鉴定为极细枝孢菌(Cladosporium tenuissimum)。2.克隆抗性基因。从筛选得到的高水平抗药性突变菌株F-2菌株中,克隆抗药性高抗性基因Cytb,同时从野生型敏感性枝孢菌菌株B-3中也克隆出Cytb抗性基因,二者Cytb基因编码区序列进行比较分析。通过普通PCR和3'RACE实验扩增出Cytb基因编码区序列全长,二者序列比对后,结果为F-2菌株在核酸编码区序列429位点处发生碱基突变,氨基酸序列中143位点的氨基酸由甘氨酸突变为丙氨酸(G143A)。因此,F-2菌株对醚菌酯药剂表现出高抗药性水平,与甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的已知抗性机制相符合。3.构建表达载体。构建Cytb抗药性突变基因的真菌ATMT表达载体,以pBHt2载体为基础,应用重叠PCR方法连接真菌表达强启动子PtrpC基因和Cytb抗性基因两个片段。然后,利用T4DNA连接酶将KpnI和HindIII双酶切后的pBHt2载体和连接目的片段连接起来,构建含Cytb抗药性基因的pBHt2重组质粒。4.农杆菌介导法转化蜡蚧菌。将构建成功的含Cytb抗药性突变基因的pBHt2重组质粒导入农杆菌AGL-1中;然后,通过农杆菌和蜡蚧菌分生孢子共培养的方法,实现农杆菌介导的蜡蚧菌的转化,将外源Cytb抗药性基因导入蜡蚧菌中,获得含Cytb抗药性基因的转化子菌株,并对转化子菌株进行一系列验证。5.转化子验证。以转化子菌株基因组DNA为模板,PCR扩增出目的片段,证明外源Cytb抗药性基因已成功导入蜡蚧菌;以转化子菌株cDNA为模板,RT-PCR扩增出目的片段,证明外源Cytb抗药性基因已成功在蜡蚧菌中进行转录反应;测定转化子菌株对醚菌酯药剂的抗药性,结果得转化子菌株对醚菌酯抗药性最高提高了7.7倍,证明外源Cytb突变基因已成功在蜡蚧菌中翻译并表达。由此获知,对醚菌酯具有抗药性的蜡蚧菌工程菌株构建取得成功,菌株抗药性显著提高,具有很好的应用前景。
【图文】：

电泳图,ITS序列,电泳图,菌株

图 2.1：ITS 序列电泳图Fig 2.1: ITS Sequence 1 为 F-1 菌株，泳道 2 为 F-2 菌株道 5 为 Y-5 菌株，泳道 6 为 CZQ-2: F-1 strain, Lane 2: F-2 strain, Lane Y-5strain, Lane 6: CZQ-2 strainCBI 网站中的 Blast 比对分析Cladosporium tenuissimum）；sporium westerdijkieae；CZQ-2 以 Talaromyces 属（曲霉属）为）构建系统发育树。由图可知F-2、B-3、C-4、Y-5 菌株与 CY-5 菌株均属于 Cladosporium Q-2 菌株属于 Penicillium 属。

枝孢菌,菌株,液体培养基,限制性内切酶

rimer rimer Mix (Colony) 98°C 10 s，55°C 10 s，72°C 20 样，1%琼脂糖凝胶电泳检测有无条+或 LB/Kan+的液体培养基中，2的限制性内切酶，酶切鉴定阳性13R 测序，，分析序列。取下图所示，从图 3.1 中可以明显看1 2 3 4 M
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ455

【参考文献】