柑桔木虱感受月桂烯和丁酸乙酯的嗅觉受体的鉴定

发布时间：2020-04-25 16:00

【摘要】：柑桔黄龙病是柑桔产业的毁灭性病害,而柑桔木虱Diaphorina citri Kuwayama是传播柑桔黄龙病病菌Candidatus Liberibacter asiaticus的主要媒介。由于迄今尚未发现能有效防治柑桔黄龙病的药剂,因此对传播媒介柑桔木虱的防治是控制柑桔黄龙病田间传播与扩散最为有效的措施。当前,化学防治是防控柑桔木虱最主要的方法。此外,基于高效诱杀柑桔木虱的绿色防控技术研发是各国学者关注的热点。本学位论文利用柑桔木虱基因组和触角转录组数据,采用RT-qPCR的方法解析柑桔木虱嗅觉受体在不同气味刺激以及在不同发育阶段的表达模式,为发掘潜在的分子靶标奠定基础。同时采用RT-PCR方法克隆柑桔木虱嗅觉受体基因DcitOR18和DcitOrco的cDNA全长序列,通过共转染进入异源表达系统(HEK293细胞),利用钙离子成像技术初步探究柑桔木虱嗅觉受体DcitOR18对月桂烯的结合活性。研究成果为揭示柑桔木虱嗅觉受体的靶标潜力以及为研制新型的引诱剂或趋避剂防控柑桔木虱提供一定的基础数据。主要研究结果如下:1柑桔木虱嗅觉受体基因表达模式解析柑桔木虱经5%月桂烯和5%丁酸乙酯分别刺激5 h,采用RT-qPCR方法解析40个嗅觉受体基因的表达模式。结果显示,共有8个嗅觉受体基因对两种气味物质的刺激产生反应。其中,在5%月桂烯刺激下,7个嗅觉受体基因的表达量出现下调,包括DcitOR4、DcitOR7、DcitOR9、DcitOR17、DcitOR18、DcitOR21和DcitOR28。在5%丁酸乙酯刺激下,仅有2个嗅觉受体基因DcitOR18和DcitOR46表达量下调。值得注意的是,相比于丁酸乙酯,柑桔木虱经月桂烯刺激后表达下调的嗅觉受体基因更多,说明柑桔木虱对柑桔挥发物月桂烯的刺激更为敏感。除此之外,DcitOR18对月桂烯和丁酸乙酯的刺激均产生反应,说明DcitOR18可能在柑桔木虱嗅觉系统具有重要作用。进一步采用实时荧光定量PCR解析非典型嗅觉受体基因DcitOrco和8个候选嗅觉受体基因在柑桔木虱不同发育阶段的表达模式。结果发现,DcitOrco在若虫和成虫期的表达量较低且相对稳定,而其余8个候选DcitORs在柑桔木虱各发育阶段均有表达,且在3-4龄若虫期表达量最高,暗示这些嗅觉受体可能在柑桔木虱3-4龄若虫期发挥重要作用。2柑桔木虱嗅觉受体基因DcitOR18和DcitOrco的cDNA克隆基于柑桔木虱基因组和触角转录组数据,采用RT-PCR技术,克隆获得柑桔木虱嗅觉受体DcitOR18和DcitOrco的cDNA全长序列。其中,DcitOR18含有1401个核苷酸,编码467个氨基酸,DcitOrco含有1386个核苷酸,编码461个氨基酸。利用TMHMM预测跨膜结构域,结果显示DcitOR18仅有4个跨膜区,而DcitOrco有7个跨膜区,符合非典型嗅觉受体的结构特征。多序列比对及系统发育树分析发现,不同昆虫嗅觉受体Orco的氨基酸序列高度保守,同源性高达70%,柑桔木虱DcitOrco在进化上亦较为保守,其亲缘关系与蚜虫的Orco更为接近。3柑桔木虱嗅觉受体DcitOR18和DcitOrco异源表达及功能验证通过改造哺乳动物表达载体pcDNA3.1(+),融入mcherry红色荧光蛋白基因,构建了表达载体pcDNA3.1(+)-mcherry。将柑桔木虱DcitOR18和DcitOrco分别插入该载体,成功构建了pcDNA3.1m(+)-DcitOrco和pcDNA3.1m(+)-DcitOR18表达质粒。将重组质粒pcDNA3.1(+)-mcherry转染HEK293细胞,检测到红色荧光信号,表明HEK293细胞表达mcherry红色荧光蛋白。进一步将上述两个表达质粒共转染进入HEK293细胞,利用钙离子成像技术,发现当加入月桂烯刺激时,细胞的荧光明显增强,而仅转染重组质粒pcDNA3.1(+)-mcherry时,HEK293细胞荧光虽有所增强,但比共转染两种重组质粒pcDNA3.1m(+)-DcitOrco和pcDNA3.1m(+)-DcitOR18时弱。为进一步确定这一关系,构建HEK293细胞稳定表达DcitOrco株系,在mRNA水平检测发现HEK293细胞过表达DcitOrco,达1400倍,但在蛋白水平未检测到DcitOrco的表达,这为全面解析柑桔木虱嗅觉受体的功能奠定了基础。
【图文】：

外部形态,若虫,非洲,病原菌

图 1.1 柑桔木虱卵及若虫（1-5th）外部形态Fig 1.1 Morphological feature of Diaphorina citri from egg to nymphs (1-5th). 柑桔木虱传播柑桔黄龙病柑桔黄龙病病菌 Candidatus Liberibacter 属于原核生物变形菌门变形菌纲韧皮部属，目前普遍认为黄龙病病菌属于革兰氏阴性菌[8]。根据黄龙病病原菌的热敏感分为耐热型的亚洲种（Candidatus Liberibacter asiaticus，Las）和美洲种（Candideribacter americanus，Lam）以及热敏感型的非洲种（Candidatus Liberibacter africanf）。目前研究发现亚洲柑桔木虱可传播亚洲种和美洲种，而非洲柑桔木虱传播非洲柑桔木虱传播柑桔黄龙病可分为获取病原菌（acquisition access period,AAP）、潜latency period，，LP，病原菌进入柑桔木虱的唾液腺）以及接种（inoculation access peP）三个阶段[1]。先前的研究表明，柑桔木虱获取病原菌所需时间为 15 min 至 1 潜伏期为 1-25 d，接种所需时间为 15 min 至 7 h[1]。随着科学技术的发展，PCR 和 qP

模式图,昆虫嗅觉,生理过程,模式图

图 1.2 昆虫嗅觉生理过程模式图（引自 Sánchezgracia[42]）Fig 1.2 Schematic of insect olfactory physiology process (originating from Sánchezgracia).2 昆虫嗅觉受体的鉴定和特性1991 年，Buck 和 Axel 首次在褐家鼠 Rattus norvegicus 鼻粘膜上鉴定了大量的体，揭开了哺乳动物嗅觉感受之谜[48]。而昆虫嗅觉受体的发现较滞后，直到rosophila melanogaster 基因组测序完成之后才鉴定出 62 个果蝇嗅觉受体[49-51]。随
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S436.66

【参考文献】