劳氏粘虫蜕皮激素合成与相关受体基因表达规律研究

发布时间：2020-04-25 20:58

【摘要】：蜕皮激素是昆虫生长发育过程中的一种重要激素,其合成与信号传导过程主要由Halloween基因与一系列下游受体参与完成,明确昆虫蜕皮激素滴度的变化趋势及其合成与信号传导通路相关基因的表达规律,对进一步阐明其对昆虫生长、发育、生殖的调控机制具有重要生物学意义。然而,作为玉米主要害虫之一的劳氏粘虫Mythimna loreyi在蜕皮激素方面的研究尚属空白。鉴于此,本论文以劳氏粘虫为研究对象,对其蜕皮激素合成通路的5个Halloween基因(Cyp307a1、Cyp306a1、Cyp302a1、Cyp315a1、Cyp314a1)和3个下游受体基因(EcR、USP、HR3)进行克隆,并在此基础上明确了这些基因在劳氏粘虫5、6龄幼虫期、蛹期及成虫期的表达及其与20E滴度变化的关系,同时探讨了成虫期20E滴度变化与产卵量之间的关系。取得的主要结果如下:1、克隆获得参与劳氏粘虫蜕皮激素合成过程的5个Halloween基因(Cyp307a1、Cyp306a1、Cyp302a1、Cyp315a1、Cyp314a1)和3个蜕皮激素受体基因(EcR、USP、HR3)。5个Halloween基因中,Cyp306a1、Cyp302a1、Cyp314a1获得完整开放阅读框;Cyp307a1、Cyp315a1获得主要片段;其推导氨基酸序列均具P450超家族保守结构域;系统发育树分析结果表明,5个Halloween基因分别与其他昆虫相应的同源序列聚在一起,形成5个分支。3个蜕皮激素受体基因中,USP和HR3获得完整开放阅读框;EcR获得主要片段;其推导氨基酸序列均具DBD与LBD保守结构域(但因EcR缺少3′端,故LBD结构域不完整);系统发育树分析结果显示,EcR与小地老虎聚在一支,USP和HR3与棉铃虫聚在一支。2、Halloween基因及相关受体基因的表达特点分析表明:(1)幼虫期:5个Halloween基因和3个蜕皮激素受体基因在5、6龄幼虫不同发育时期表达量基本呈周期性变化,其中Halloween基因在5、6龄幼虫中均是后期高,前期低;EcR与USP在6龄幼虫的表达量显著高于其在5龄幼虫的表达量,而HR3则与之相反。(2)蛹期:5个Halloween基因在劳氏粘虫雌、雄蛹不同时期均有表达,但表达规律及不同时期表达量不同。雌蛹中,各基因均在初化蛹与化蛹后216h时有较高表达量,整体表达规律较为相似,呈先下降后上升趋势。其中,Cyp307a1在初化蛹时表达量最高,显著高于其他时期;Cyp314a1在化蛹72h时表达量最高,显著高于其他时期;Cyp306a1、Cyp302a1、Cyp315a1均在化蛹72h时表达量最低,216h时最高,二者之间差异显著;EcR和USP各时期表达量差异显著;HR3在初化蛹时表达量较低,化蛹216h时表达量最高,二者间存在显著性差异。雄蛹中,除Cyp307a1外,其他4个Halloween基因的表达量均呈先上升后下降趋势;其中,Cyp306a1、Cyp302a1、Cyp315a1均在化蛹168h时表达量最高,显著高于其他时期;Cyp314a1虽在化蛹120h时表达量最高,但与72h、168h之间差异不显著。EcR、USP、HR3基因表达模式较为相似,均在化蛹168h时出现表达量峰值,至216h时降至较低水平,差异显著。(3)成虫期:5个Halloween基因及3个受体基因在雌、雄成虫各发育时期均有表达,且雌、雄间差异显著。3、Halloween基因及相关受体基因的组织表达分析结果显示:Cyp307a1、Cyp306a1、Cyp302a1、Cyp315a1均在前胸腺中表达量最高,其他组织中较低;Cyp314a1在马氏管中特异性高表达。EcR、USP、HR3均在马氏管中表达量最高,前胸腺中表达量最低,前者分别是后者的9.05、79.20、13.05倍。4、不同发育时期20E滴度测定结果表明:幼虫期,5、6龄幼虫发育后期20E滴度较前期高;蛹期,初化蛹时20E滴度最高,化蛹后120h降至最低,之后又上升至较高水平;成虫期,20E滴度在成虫羽化48h之内一直维持在较低水平,羽化后72h出现一个小高峰,羽化后96h出现最低值,之后又基本回升至羽化72h时的水平。5、不同发育时期20E滴度与相关基因表达模式间的关系分析结果表明:劳氏粘虫幼虫、蛹、成虫期20E滴度变化与基因表达量有较强的相关性;幼虫期与蛹期,除Cyp314a1外,其他基因表达量变化与20E滴度变化趋势相似,均为各龄初期低,后期高;但各基因在6龄幼虫的表达高峰与20E滴度峰值并不一致,而是前者较后者提前,此现象在蛹期也有出现。成虫羽化前期20E滴度较后期低,最大值出现在羽化后120h,Cyp307a1、Cyp302a1、Cyp315a1和HR3表达量变化趋势与之相似;与20E滴度在整个成虫期波动较大不同,Cyp314a1虽在羽化前期表达量较后期高,但在整个成虫期变化不大。6、雌成虫20E滴度与产卵量的关系分析结果表明:雌成虫20E滴度具两个高峰,第一个小高峰在羽化后72h,此时对应成虫产卵初期,随日产卵量高峰的出现,20E滴度降至最低值,二者趋势相反,24h后20E滴度又迅速上升至最高值,此时日产卵量开始呈下降趋势;表明20E参与成虫生殖过程,且高滴度的20E可能对产卵有抑制作用,较低滴度20E则促进产卵。
【图文】：

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第二章劳氏粘虫 Halloween 基因与蜕皮激素相关受体基因克隆与序列分析yp314a1），其中 Cyp306a1、Cyp302a1、Cyp314a1 获得完整开放阅读框，长度分别620 bp、1530 bp、1551 bp，分别编码 539、509、516 个氨基酸残基；Cyp307a1、Cyp31得主要片段，，长度分别为 1275 bp、1185 bp，分别编码 425、395 个氨基酸残基。（https://web.expasy.org/protparam/ ）网站预测 Cyp306a1、Cyp302a1、Cyp314a1论等电点（pI）分别为 6.56、9.23、9.03，蛋白分子量（MM）分别为 61.48 kDa、58Da、58.15 kDa；结构域预测结果表明，以上 5 个基因的氨基酸序列均具 P450 超家守结构域（图 2.1）；氨基酸序列比对分析发现，Cyp306a1、Cyp302a1、Cyp315a1yp314a1 的 5 个 P450 结构单元（Helix-C、Helix-I、Helix-K、PERF motif 及 Heme-bindomains）在不同物种间高度保守，但 Cyp307a1 的 Helix-C 和 Helix-I 结构域不保守（.2 至图 2.6）；系统发育树分析结果显示，劳氏粘虫 5 个 Halloween 基因的氨基酸序与其他昆虫的同源序列聚在一起，形成 5 个分支，且与甘蓝夜蛾 Mamestra brassi缘关系最近（图 2.7）。

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但 Cyp307a1 的 Helix-C 和 Helix-I 结构域不保守（图2.2 至图 2.6）；系统发育树分析结果显示，劳氏粘虫 5 个 Halloween 基因的氨基酸序列均与其他昆虫的同源序列聚在一起，形成 5 个分支，且与甘蓝夜蛾 Mamestra brassicae亲缘关系最近（图 2.7）。图 2.1 劳氏粘虫 5 个 Halloween 基因的保守结构域Fig 2.1 Predicted conserved domain of 5 Halloween genes of Mythimna loreyi
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S433.4

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