基于mRNA富集的水稻条纹病毒“帽子序列谱”的获得与分析

发布时间：2020-04-26 12:27

【摘要】：水稻条纹病毒(Rice stripetenuivirus,RSV)是白细病毒科(Phenuiviridae),纤细病毒属(Tenuivirus)代表成员,其基因组含4条单链RNA,通过负义或双义策略共编码7个蛋白。与其它分段负义RNA病毒(sNSV)一样,RSV在基因表达过程中采用“抓帽”机制,即从寄主mRNA抓取一段10-20个碱基的帽子序列,以之作为引物起始转录,合成5'端含一段异源序列的病毒mRNA。最近,本实验室利用高通量测序技术获得了 RSVNP和NCPmRNA的帽子序列,为解析RSV的“抓帽”机制提供了许多新的视角。然而,由于RSV其它mRNA相对于基因组RNA(或其互补链)的含量太低,在经过多次尝试后,我们无法获得它们的帽子序列,因而我们不能确定所得数据是否具有偏颇。尤其,我们发现RSV在合成NP和NCP mRNA时,使用“引发与重配”(prime-and-realign)机制的频率不同,但不确定RSV合成其它mRNA时是否也存在这种差异。查阅文献发现,eIF4E蛋白能结合mRNA的帽子结构。已有研究者通过基因改造,提高了 eIF4E对帽子结构的亲和性。也已有研究者利用eIF4E蛋白突变体(eIF4EK119A)富集含帽子结构的RNA。基于此,本研究尝试利用eIF4EK119A富集RSV mRNA,进而获得更完整的RSV帽子序列谱。首先,本研究将eIF4EK119A构建到带GST标签的原核表达载体pGEX-4T-3,所得重组质粒转Rosseta菌株;通过优化条件(IPTG终浓度为0.25 mMol,16 ℃、180rpm、10-13 h)获得 eIF4EK119A 蛋白;将 eIF4EK1 19A 蛋白(GST磁珠结合)与提取自RSV侵染水稻的60μg总RNA混合,以免疫共沉淀的方式获得富集的mRNA 3 μg;以富集的mRNA为底物,利用本实验室已建立的技术,先对 RSVNVS2、NSvc2、NS3、NCP 和 NSvc46 种 mRNA 的 5'端进行了传统的克隆和测序。结果表明,所得序列90%含帽子序列,这表明本研究成功以 eIF4EK119A 富集了 RSV mRNA。本研究接着以富集的RSV mRNA为材料,利用Cap-seq技术,获取了NS2、NSvc2、NS3、NP、NCP和 NSvc4 6 种 mRNA 的“帽子序列谱”,分析结果表明:(1)在合成各mRNA时,RSV的“抓帽”模式无明显差异;(2)RSV在转录病毒链时比转录互补链时更频繁地使用“引发与重配”机制,其结果是RSV病毒链的转录物比互补链的转录物具有更长和更复杂的帽子序列。本研究利用eIF4EK119A蛋白实现了 RSVmRNA的富集,并在此基础上,首次获得了一个较为完整的RSV“帽子序列谱”。以此为基础,本研究首次表明RSV在转录病毒链时比转录互补链时更频繁地使用“引发与重配”机制,这为进一步认识RSV的“抓帽”机理迈出了重要一步。
【图文】：

序列,病毒,机制,流感病毒

结构；而多分体负义ＲＮＡ病毒普遍采用的一种策略是，从寄主那里夺取一段含逡逑帽子结构的ＲＮＡ序列，来作为引物起始自身ｍＲＮＡ的转录（Ｄｅｃｒｏｌｙｅ／ａ／．，逡逑２０１２），生成５＇端含有一段“异源”帽子序列（来源于寄主，如图１邋－邋１邋）的病逡逑毒ｍＲＮＡ邋（ＤｅｃｒｏｌｙｅＭ／．，，２０１１），该过程被称为“抓帽”机制。逡逑５，逦？丨丨＿丨｜＇逡逑丨邋丨逦逦｜逡逑ｙ逦ｙ逡逑异源帽子序列逦病毒序列逡逑图卜１邋“抓帽”病毒的ｍＲＮＡ结构。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１邋Ｔｈｅ邋ｍＲＮＡ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ａ邋“ｃａｐ－ｓｎａｔｃｈｉｎｇ”邋ｖｉｒｕｓ邋．逡逑１．１．１逦“抓帽”机制在流感病毒上的发现逡逑“抓帽”最早发现于感病毒。早在上世纪７０年代中后期，研究者就发现逡逑了一些相关的证据，并最终揭示了这一现象：（１）寄主的聚合酶ＩＩ邋（Ｐｏ丨ＩＩ）逡逑活性影响流感病毒的侵染和增殖（Ｓｐｏｏｎｅｒ邋ａｎｄ邋Ｒｉｃｈａｒｄ，邋１９７７）邋；逦（２）虽然体内逡逑合成的流感病毒ｍＲＮＡ含有帽子结构，提纯的流感病毒粒子却无加帽活性逡逑（Ｋｒｕｇｅ／？／．，邋１９７６；邋Ｐｌｏｔｃｌｉ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋１９７８）邋；逦（３）在体外转录体系中，加入含帽子逡逑结构的ｍＲＮＡ能显著提高流感病毒的转录活性（Ｂｏｕｌｏｙｅ／？／．

条纹,侵染,水稻,症状

型方式传播并且可经卵垂直传播给下一代，被感染的水稻植株叶片早期出现与叶逡逑脉平行的浅绿色条纹斑，随着病毒含量的增加后期呈现出萎黄和坏死的条纹斑逡逑（图１－４）邋（ＦａｌｋａｎｄＴｓａｉ，１９９８）。该病毒可侵染８０种禾本科植物带来严重逡逑危害，除了最适寄主水稻和过冬杂草以外，还可以侵染小麦、看麦娘和早熟禾等逡逑（阮义理等，１９８６；周益军等，２０１２）。实验条件下，ＲＳＶ可通过摩檫接种，逡逑侵染实验模式植物本氏烟和拟南芥（Ｆｅｎｇ邋ｅ／邋ｃｉ／．，邋２０１１；邋Ｘｉｏｎｇ邋ｅ／邋ｆｌ／．，邋２００８）。逡逑ＭＢ逡逑图１＞４水稻条纹病毒（ＲＳＶ）侵染水稻产生的症状（袁正杰，２０１２）。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－４邋Ｓｙｍｐｔｏｍｓ邋ｏｆ邋ｒｉｃｅ邋ｃａｕｓｅｄ邋ｂｙ邋Ｒｉｃｅ邋ｓｔｒｉｐｅ邋ｔｅｎｕｉｖｉｎｉｓ邋（ＲＳＶ）邋（Ｙｕａｎ，邋２０１２）．逡逑在丨８９７年，ＲＳＶ在日本被首次报道，随后在东亚的许多国家被检测到，逡逑其中包括中国。１９６０－１９７２年和１９７７－邋１９８６年ＲＳＶ在日本地区发生两次爆逡逑发，之后由于介体昆虫灰飞虱的迁入，ＲＳＶ于２００８年在日本西部流行（Ｏｔｕｋａ逡逑ｅｒａ／．
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S432.41

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