苏云金芽胞杆菌中Crp调控的lpm和glnRA基因功能分析

发布时间：2020-04-27 22:37

【摘要】：苏云金芽胞杆菌(Bacillus thurigiensis,Bt)是一种革兰氏阳性菌,广泛地存在于自然界中。Bt最大的特点是可以在形成芽胞的同时形成伴胞晶体,伴胞晶体进入昆虫体内后会在一系列的作用下形成具有杀虫活性的杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins,ICPs),对昆虫产生毒杀作用。鳞翅目昆虫(Lepidoptera)作为我国农业害虫之一,属于Bt的靶标昆虫,其幼虫中肠呈微氧且偏碱的pH环境。碱性环境有利于伴胞晶体发挥毒性,但对于Bt来说却是一种环境胁迫,因此,研究Bt的碱耐受性十分重要。实验室前期通过碱刺激芯片等技术手段研究发现L-乳酸在Bt的碱耐受性中起到关键作用。本研究在此基础上,以亚洲玉米螟(ACB-BtS)为供试昆虫对Bt L-乳酸代谢途径中相关基因的缺失突变株进行生物活性检测,发现缺失L-乳酸透性酶基因lpm及转录因子crp基因后,Bt的毒力均会受到影响,进一步证明L-乳酸代谢对于Bt的重要性以及转录因子Crp在Bt杀虫活性中的重要作用。其中,转录因子Crp编码的CRP蛋白又称cAMP受体蛋白,其在大肠杆菌中调控近200个功能基因,而在Bt中未见相关的报道,为了探索Bt中转录因子Crp在碱性条件下调控的功能基因网络,本研究提取了Bt HD73和HD(Δcrp)菌株在28 mM碱处理下的总RNA,利用高通量测序手段对其进行RNA-seq分析。发现在28 mM碱处理条件下,Bt中受crp调控的基因约有1382个,受其正调控的有528个,负调控的有754个,这些功能基因主要富集在碳代谢、氨基酸代谢、能量代谢和氮代谢等途径中。转录组数据显示,在谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)代谢途径中的谷氨酰胺合成酶基因glnA(Gene ID:HD73_3986)和谷氨酰胺合成酶抑制子基因glnR(Gene ID:HD73_3987)均受转录因子Crp调控。谷氨酰胺合成酶广泛存在于生物体中,参与众多代谢途径中,为了研究Bt中相关基因的转录调控及对Bt杀虫毒力的影响,本研究构建了glnRA操纵子的启动子融合lacZ基因的表达载体,测定HD73和HD(Δcrp)菌株中PglnRA的转录活性。同时,本研究构建了谷氨酰胺合成酶抑制子基因glnR(Gene ID:HD73_3987)的缺失突变株及谷氨酰胺合成酶过表达菌株,分析谷氨酰胺合成酶的转路及过表达。本研究主要结果阐述如下:1.Bt芽胞可以提高Cry蛋白的杀虫活性本研究通过对不同浓度Bt芽胞及相对浓度的Cry1AC晶体蛋白混合物的杀虫活性进行检测,发现在亚致死浓度的Cry1AC蛋白饲喂条件下,加入一定浓度的Bt芽胞可以有效增加其对亚洲玉米螟的杀虫活性。此方法可以更直观地确定相关基因对Bt杀虫活性的影响。2.L-乳酸代谢参与到Bt的碱适应性本研究通过构建L-乳酸透性酶基因的缺失突变株HD(Δlpm),使用上述的生测方法,测定L-乳酸代谢相关基因缺失突变株HD(Δcrp)和HD(Δlpm)的杀虫活性,发现缺失这些基因后Bt的杀虫活性会显著降低,同时测定其碱刺激下基因启动子的转录活性,从而明确L-乳酸代谢参与到Bt的碱适应性中。3.明确谷氨酰胺合成酶代谢对Bt杀虫活性的影响结合转录组数据发现,转录因子Crp会正调控谷氨酰胺合成酶代谢途径中相关基因的转录。为了验证这一结论,本研究测定谷氨酰胺合成酶操纵子glnRA的转录活性,结果与转录组数据一致。为了明确谷氨酰胺代谢在Bt杀虫活性中起到的作用,本研究从转录和过表达两个方面对其进行研究,构建谷氨酰胺合成酶抑制子基因glnR的缺失突变体及谷氨酰胺合成酶基因glnA的过表达菌株。结果发现,在营养丰富时,glnR会负调控操纵子glnRA的转录。同时,过表达谷氨酰胺合成酶后,Bt的杀虫活性得到了显著的提高。
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S476

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本文编号：2642726