致病疫霉拮抗菌WL2及其脂肽的防病促生作用研究

发布时间：2020-05-11 13:03

【摘要】：自2015年国家提出马铃薯主粮化战略以来,国内马铃薯的种植面积和产量逐年递增。然而由致病疫霉(Phytophthora infestans)引起的马铃薯晚疫病是马铃薯种植过程中影响最大,破坏性最强的病害,因此,如今晚疫病已被视为国际第一大作物病害。目前防治马铃薯晚疫病的主要手段有农业防治、培育抗病品种、化学农药防治和生物防治等。不可否认的事实是农业防治技术费时费力且不能从根源上消除晚疫病的侵染,病原菌的迅速变异和交配型的日益复杂,抗病品种的培育速度远远不及病原菌引起的种薯抗性丧失速度,其次化学农药的不断选择作用已经导致致病疫霉更加频繁的变异,加之化学农药大量喷施造成的人类生存环境污染已不容忽视。因此,探索新型高效、安全且环保的生物防治手段迫在眉睫。近几年以微生物活体及其代谢产物为核心的生物防治技术因其具有防治效果突出、对环境无污染、不易引起病原菌耐药性等特点而备受学者关注。本研究室在近几年也筛选出了WL1、M15和WL2等6株对致病疫霉有显著抑制作用并在离体组织试验中有突出防病效果的菌株。由于这些菌株是由我实验室在不同时期筛选获得的菌株,关于这几株菌究竟哪株菌更具生防潜力,值得进一步比较和探讨,此外关于最具生防潜力菌株的分类地位、抑菌活性稳定性及其抑菌活性物质类别也有待进一步明确。本试验的主要研究内容包括:(1)进一步比较对致病疫霉有一定抑制效果的6株菌在抑制致病疫霉菌丝生长、孢子囊萌发和离体组织上防控马铃薯晚疫病的能力,筛选出综合生防潜力最强的菌株;(2)明确最具生防潜力菌株(WL2)抑菌活性稳定性及菌株分类地位;(3)分析该菌株(WL2,经鉴定为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis)产脂肽能力及所产脂肽种类;(4)明确WL2菌株产生的脂肽物质在马铃薯晚疫病方面的防治效果和对马铃薯植株的促生作用。本试验获得的研究成果如下:1、通过比较6株菌的生防效果,明确了菌株WL2最具生防潜力,其菌活体、菌液和无菌体发酵液抑菌带宽均大于26 mm,对致病疫霉菌丝体致畸率达到38.7%,在该菌株最低菌液浓度(1×10~4cfu/mL)抑制下,释放游动孢子、孢子囊直接萌发和游动孢子萌发比率都是最低,依次为33.8%、28.3%和35.4%,此外WL2菌株在离体叶片和块茎上的防病效果都是最好,相对保护率分别为81.2%和80.5%。2、对WL2菌株进行培养特性观察、生理生化测定和16S rDNA序列分析,明确了WL2菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。3、WL2菌株抑菌作用稳定,无菌体发酵液经121℃高温处理后,抑菌率高于50%;经pH值2~12处理后,抑菌率大于70%;在紫外线下照射12 h,抑菌率也能高于77%,还发现发酵液在4℃环境下可储存1年、且保留抑制活性基本不变。4、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)WL2具有产脂肽的能力,该菌株可产生明显的嗜血圈,噬油圈,发酵液具有驱油效果,能产生直径高达4.9 cm的驱油圈,并且发酵液乳化性能百分数高达85.5%。5、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)WL2可产生IturinA和Surfactin两类脂肽物质。6、脂肽物质对致病疫霉均有一定的抑制作用,其抑制效果与其浓度呈现依赖关系,当脂肽浓度为25μg/mL时,抑菌圈直径为5.9mm;当脂肽浓度为3μg/mL时,孢子囊直接萌发率仅为9.7%;脂肽浓度为4μg/mL时,游动孢子释放率仅为7.6%,并且脂肽抑制孢子囊释放和直接萌发都仅需1.5h。7、脂肽物质对晚疫病均有显著的预防和治疗效果,其中预防效果明显优于治疗效果,20μg/mL的脂肽预防晚疫病,在离体块茎和叶片上的病情指数分别为20.6和17.5(对照组分别为73.1和78.2);此外脂肽可显著促进马铃薯块茎PPO、POD和PAL 3种生防酶活性的提高。8、脂肽对马铃薯植株的生长有一定的促进作用,可促进植株叶绿素总含量提高15%左右,促进地下部分根增粗11.9%和根干重提高11.2%,同时脂肽还可促进马铃薯植株地上部分主茎增粗9.8%和主茎干重提高16.7%,促进后代子薯增产约14.8%。
【图文】：

孢子囊,游动孢子,卵孢子,有性生殖

孢子囊；B:孢子囊产生游动孢子；C:孢子囊释放游动孢子；D:静止孢萌发 E:附着胞孢子囊直接萌发.图 1-2 致病疫霉各时期形态（王游游拍摄于 2015 年）Fig.1-2 P. infestans spore morphology in different development phase

分子结构式,物质,枯草芽孢杆菌,脂肽

河北大学理学硕士学位论文和铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）等都有抑制作用[75]。枯草芽孢杆菌产生的 iturin 和fengycin 除了对细菌有广泛的抑制作用[69]，还对植物病原真菌有突出的的抑制效果[76]。Leclere V[77]实验结果表明枯草芽孢杆菌（B. subtilis）BBG100 产生的脂肽类物质可显著预防番茄种子感染瓜果腐霉病（Pythium aphanidermatum），并且验证了脂肽物质对种子的萌发和生长也起到了促进作用。Ongena M[78]研究表明，，枯草芽孢杆菌 M4（B. subtilis）代谢产生的脂肽物质 fengycin 可有效保护大豆种子和苹果免受灰葡萄孢菌（Botrytiscinerea）的侵扰。J Liu[79]的实验结果表明，枯草芽孢杆菌突变菌株 JA026 代谢产生的fengycin 物质对引起小麦根腐病的镰孢菌（Fusarium spp.）具有一定的抑菌作用。D.Romero[80]明确了 Bacillus subtilis 分泌的 iturin 和 fengycin 脂肽物质对引起西葫芦、南瓜白粉病的病原菌白粉病菌（Erysiphe cucurbi-tacearum (Zheng) ）有较强的的抑制作用。
【学位授予单位】：河北大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S435.32;S476

【参考文献】