类速激肽Natalisin及其受体SIA32在斜纹夜蛾生殖行为调控中的功能研究

发布时间：2020-05-12 12:59

【摘要】：斜纹夜蛾(tobaccocutworm,Spodopteralitura)属鳞翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae)。斜纹夜蛾是一种世界性的多食性大害虫,是我国粮、棉、烟草等经济作物,尤其是蔬菜的重要害虫。该害虫可危害109个科共380多种植物,包括蔬菜、果树、花卉、草坪、棉花、玉米和烟草等。昆虫生殖行为,是研究性选择和物种进化的基础,对害虫防治和益虫利用也有重要意义。神经肽是一类特殊的重要信息物质,主要由脑及其他神经分泌细胞所分泌,具有种类多、含量低、活性高等特点,广泛调节着动物的发育、生理和行为过程。类速激肽(tachykinins,TKs)是存在于脊椎动物中的一类特殊的神经肽。其代表成员有TKs I~IV,DTK1~6和Natalisin(NTL)。NTL存在于果蝇、赤拟谷盗和家蚕等昆虫中。前人研究发现NTL在果蝇中可能与交配行为有关,而在赤拟谷盗中则具有调节雌虫产卵的功能,然而NTL在家蚕或其他蛾类昆虫中是否也具有类似功能有待明确。基于上述,本研究在前期转录组测序的基础上,进一步通过RACE技术克隆了斜纹夜蛾ⅣTL及其受体NTLR(SLA32)基因的全长mRNA序列;再通过实时荧光定量技术检测了整个斜纹夜蛾生活史和成虫不同组织中NTL及SLA32的相对表达水平;最后采用细菌介导的RNA干扰技术对ATL和SLA32进行了功能分析,具体结果如下:(1)NTL mRNA序列全长1593 bp,其5'端和3'非编码区(UTR)分别为95 bp和181 bp,其开放阅读框(ORF)为1317bp,编码一个438个氨基酸残基组成的蛋白。SLA32 mRNA全长1618 bp,其5'和3'UTR分别为62 bp和233 bp,其ORF为1323 bp,编码一个含440个氨基酸的蛋白。同源性分析表明,斜纹夜蛾的NTL和SLA32基因所编码的蛋白与鳞翅目昆虫表现出很高的同源性,与其他目的昆虫则同源性较低。通过跨膜结构域预测分析表明S1A32是一种典型的G蛋白偶联受体(GPCR)。(2)实时荧光定量分析表明NTL和和SLA32在不同发育时期的表达模式相似,即在卵和幼虫阶段较低、在蛹期有所升高而在成虫期达到最大,这与该蛾的性成熟和生殖行为发生呈正相关。然而在成虫期间,SLA32的相对表达量都较NTL有延后现象,即NTL分别在0日龄雄虫和1日龄雌虫中出现最高表达,而SLA32则在1日龄雄虫和2日龄雌虫中出现最高表达。这一结果表NTL和SLA32关系密切,NTL表达可能有助于促进SLA32的表达。NTL和SLA32在斜纹夜蛾不同组织中的表达也表现出一定的规律性,即头部的表达量都高于胸部和生殖系统,并且从头部往下呈现明显的递减趋势,雄虫头部的表达量高于雌虫头部的表达量。这种性间和组织间差异性表达暗示NTL和SLA32在雌雄间和不同组织间可能产生不同的功能。(3)成功构建了NTL和SLA32的细菌介导的RNA干扰体系,并达到了较高的干扰效率(60%以上)。干扰NTL和SLA32的表达显著降低了斜纹夜蛾雄虫的求偶和雌虫的召唤行为,最终导致较低的交配成功率。对照组(喂食无菌水和喂食表达EGFPdsRNA的大肠杆菌)雌性成虫的交配百分率分别为l100%和92%,对照组雄虫交配百分率分别为85%和77%,都有较高的交配率。但实验组(喂食表达NTLdsRNA和SLA32 dsRNA的大肠杆菌)雌雄虫交配百分率都比较低(23-46%)。干扰雌虫NTL和SLA32的表达显著降低了雌虫的产卵量。干扰雄虫NTL及SLA32的表达后,与NTL及SLA32 RNAi雄虫交配的正常斜纹夜蛾雌虫其交配后产卵量有所下降。这些结果表明NTL及其受体SLA32在斜纹夜蛾雌性和雄性生殖行为过程均具有重要作用,并表现出明显的性间功能差异性和不同的分子机制。本研究首次克隆了斜纹夜蛾NTL及其受体SLA32基因的全长mRNA序列,并通过RNAi证实了 NTL和SLA32在斜纹夜蛾生殖调节过程中的重要作用。本研究也属首次在鳞翅目昆虫中证实了NTL和SIA32的功能,为该类昆虫繁殖机制的深入探索提供了思路。本研究还首次在斜纹夜蛾中构建了细菌介导的RNA干扰体系,细菌介导的RNA干扰技术是一种成本低、高效和一次制备可多次培养使用的基因沉默方法,可在功能研究中广泛应用,并在害虫防治方面也有较好应用前景。
【图文】：

６、假死性：斜纹夜蛾幼虫具有假死性，当受到惊动时，身体蜷缩成一团假死状。逡逑７、趋光性：成虫大多在夜晚进行取食、交配和产卵，飞行能力较强，对具有强烈的趋性。逡逑８、迁飞性：当环境恶劣，食物不足时，斜纹夜蛾常常成群徖徙。逡逑．２．３斜纹夜蛾各个时期形态特征逡逑斜纹夜蛾生活史同其他完全变态类昆虫一样具有四个不同的时期：卵、幼、成虫，其中幼虫又可分为六个龄期。逡逑卵：斜纹夜蛾的卵集中产成块状，一般为２、３层不等的无规则块状，初黄白色，上面覆有黄色的体绒毛（图１－１：邋Ａ）。每粒卵为直径０．４？０．５ｍｍ球形，表面网纹状，有横脊和纵棱［１６］，孵化前卵呈紫黑色（图Ｍ：邋Ｂ）。逡逑

Ａ：初孵幼虫；Ｂ：在人工饲料上取食的－一龄幼虫；Ｃ：邋１－６龄幼虫：１为一龄幼虫，２为二龄逡逑幼虫，３－４为三龄幼虫，５－７为四龄幼虫，８－９为五六龄幼虫，９为蜷缩状（即将化蛹）逡逑二龄幼虫（图１－２：邋Ｃ－２）：孵化后５？７天，此时幼虫体长达４？５邋ｍｍ，体表具逡逑有排列不整齐的不规则黑点，二龄幼虫可见背线、亚背线和气门。以肉眼可见幼虫逡逑具有三对胸足、四对腹足和一对臀足。二龄幼虫的假死性和隐蔽性X椙浚�受到惊吓逡逑时也会吐丝下垂，爬行时呈拱形，逐渐分开取食叶片，，食量也明显增大，后期停止逡逑进食，开始蜕皮，粪便呈绿色颗粒状。由于食量的增大，可明显观察到幼虫啃食叶逡逑片后仅剩叶上表皮和叶脉，二龄幼虫时期也是摘除幼虫的最佳时期。逡逑三龄幼虫（图１－２：邋Ｃ－３，４）：在孵化后８？９天，斜纹夜蛾幼虫进入三龄阶段，逡逑此时，虫体长达１５？１６＿，体色由乳白变为黄色，有少数黑色或紫炓�

本文编号：2660254