解淀粉芽孢杆菌MG-3抗菌蛋白的纯化与性质研究

发布时间：2020-05-12 09:28

【摘要】：从芒果的叶和茎的组织中分离并鉴定得到解淀粉芽孢杆菌MG-3,该菌株能够分泌多种抑制果蔬病害真菌的活性物质。本文对解淀粉芽孢杆菌MG-3分泌抗菌蛋白的分离纯化及其性质进行研究。本实验将解淀粉芽孢杆菌MG-3培养得到发酵液,先采用硫酸铵分级沉淀法,按20%,40%,60%的硫酸铵饱和度分离浓缩粗蛋白,再采用DEAE-650C弱阴离子交换层析和Sephacry1 S-200凝胶层析的技术组合策略,分离纯化粗蛋白。以枇杷焦腐病菌为供试菌株,验证抗菌蛋白的抗菌活性;并用SDS-PAGE电泳分析抗菌蛋白为单一组分,分子量大约45KDa。利用MALDI-TOF/TOF质谱鉴定抗菌蛋白,结果表明抗菌蛋白很可能是丝氨酸蛋白酶,分子量大约48147.1Da。对纯化到的抗菌蛋白进行稳定性研究,实验结果表明抗菌蛋白具有良好的稳定活性,无论温度,pH,紫外线等处理条件怎么变化,抗菌蛋白的相对活性都维持在70%以上。其中蛋白酶K对抗菌蛋白的活性几乎没有影响;抗菌蛋白100℃处理30min后,仍能保持70%相对活性。研究测定抗菌蛋白浓度对枇杷焦腐病抑制效果的影响,抗菌蛋白对病害菌的作用方式及抗菌蛋白的广谱性。实验结果表明:半数抑菌浓度(IC50)是40.58ug/mL,最小抑菌率(MIC)是80.60ug/mL及最小杀菌率(MBC)是119.8ug/mL;抗菌蛋白不仅能够降解病害真菌的菌丝,也能抑制病害菌的分生孢子的萌发;抗菌蛋白能够抑制枇杷焦腐病菌,枇杷炭疽病菌,橄榄焦腐病菌,荔枝焦腐病菌等多种果蔬病害真菌,具有良好的广谱性;还能保护枇杷,延迟枇杷的存储时间。根据抗菌蛋白的质谱的鉴定结果和NCBI数据库比对分析,设计带有酶切位点引物,以解淀粉芽孢杆菌MG-3的基因组作为模板,PCR扩增目的片段基因,将目的片段基因与PMD18-T载体连接,转化到大肠杆菌,测序。将含有目的片段基因的T载体与PET-28a的载体双酶切,再将目的片段与酶切的PET-28a载体连接,构建成表达载体,转化到大肠杆菌中。用IPTG诱导目的片段基因在大肠杆菌表达,离心,破碎菌体,采用镍柱层析法纯化重组蛋白,同样以枇杷焦腐病菌作为供试菌株,验证重组蛋白的抗菌活性。
【图文】：

１．３．２．３疏水相互作用色谱逡逑疏水相互作用色谱是将混合物中的物质用盐类物质，使其蛋白质中的疏水基团暴逡逑露出来，与疏水层析的非极性介质结合的一种分离方法，见图１－３。疏水层析是由逡逑丁１５“１１５［８６］于１９４８年发现的，通常用来分离不易用离子交换层析和凝胶交换层析纯化逡逑的物质。蛋白质经过高盐浓度处理后，与疏水层析中固定相结合，，逐渐降低洗脱液中逡逑的盐浓度，使蛋白质发生可逆反应，不再与疏水介质结合，洗脱下来。因为这过程存逡逑在使蛋白质活性受损的可能，只用在其他层析方法不能纯化到目的蛋白的情况，才使逡逑用疏水层析。逡逑９逡逑

亲和层析具有很强的专一性，纯化程度高等特点。亲和层析是根据层析介质与蛋逡逑白质之间的生物学活性，不是依据两者之间的物化特性进行分离。亲和层析的配基与逡逑混合物中某一蛋白质能够特异性结合，而且可以可逆反应，见图１－４。一般使用于带逡逑有标签的重组蛋白的纯化或者抗原与抗体之间的分离纯化。因为该方法具有局限性，逡逑而且成本相对高，较少用于天然蛋白的纯化。逡逑（１）逦（２）逦（３）逡逑｜Ａ邋＞Ｘ＾｜ＡＷａＳｈ＾逡逑ＪＣ邋Ｓａｍｐｌｅ邋Ｍ邋｜邋ｗｔ邋＾逡逑ｋｔ邋Ｌ邋＼ｍｂ邋＼：ｋ逡逑亲和基团＾邋ｉ逦＾逡逑ｆ配体＊７…ｒ逡逑Ａ■S缅澹ｅ澹ｅ澹ｅ危拢縢？逡逑载体逡逑图１－４亲和层析原理示意图逡逑Ｆｉｇ．邋１－４邋Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ邋ｏｆ邋ａｆｆｉｎｉｔｙ邋ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ逡逑１０逡逑
【学位授予单位】：福州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S476

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本文编号：2660005