白星花金龟幼虫小分子抗菌肽预测及生物活性分析

发布时间：2020-05-12 20:42

【摘要】：近年来,由于抗生素药物的广泛使用,使耐药病原体发展极为迅速,加之新抗生素分子的批准率的降低,导致了全世界的死亡率增加。因此,急需研究发现新的、不易引发耐药性的抗菌物质。抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)是生物体受到微生物感染,由自身免疫产生的一类多肽物质,能够对全身进行自我防御,与靶向特定细胞内酶或DNA相作用的常规抗生素相比,AMPs由于长度短,组成简单,蛋白酶稳定和膜靶向作用这一独特的作用机制,物理且迅速地渗透并破坏细胞质膜,导致难以修复的损伤,而不易产生耐药性,且不会对哺乳动物正常细胞造成伤害。因此,微生物产生抗性的几率比抗生素低得多。这表明AMPs可以通过克服抗生素固有的缺点而被开发为新的治疗解决方案。有研究报道从鞘翅目昆虫白星花金龟幼虫(Protaetia brevitarsis Lewis larvae)中提取并分离纯化出了具有抗菌作用的物质,本实验室通过以其全基因组序列作为实验的序列资源,并与抗菌肽数据库(APD3)收集的抗菌肽进行比对,获得天然AMPs作为模板,结合AMPs序列特征,个别模板使用氨基酸替代法,利用一系列生物信息学网站软件,预测筛选获得的候选小分子AMPs的可能性,并送公司进行合成,所有AMPs纯度达到95%以上,通过对模板肽的结构分析,列举了30条候选小分子AMPs,通过比较理化参数,筛选出16条参数较优的多肽作为候选肽序列,其中,最优的抗菌肽为10号VFRLKKWIQKVI,所带正电荷最高(+4),疏水残基比率也相对较高,且不稳定系数极低(-4.98),二级结构以α-螺旋为主;对小分子抗菌肽进行一系列生物活性实验验证,通过琼脂打孔法、微量液体稀释法和菌落计数法测定设计的小分子多肽分别对5种菌(大肠杆菌、铜绿假单胞菌、苏云金芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌)的抗菌活性、最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)、分析抗菌肽对菌生长的影响,并绘制时间-杀菌曲线,确定抗菌效果。活性实验初筛显示获得了5条(4号IVHLLTKMTK、10号VFRLKKWIQKVI、12号KIYVLLRRQA、14号ANWKKVIR、15号STLHLVLRLR-NH_2)抗菌活性高的小分子AMPs,其中以10号VFRLKKWIQKVI抑菌效果为最优,不仅对两种革兰氏阴、阳性菌都具有良好抑菌效果而且对真菌中的白色念珠菌也具有明显抑菌作用,其对大肠杆菌、铜绿假单胞菌的最低抑菌浓度均为16μg/mL,最低杀菌浓度均为32μg/mL,对苏云金芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌最低抑菌浓度分别为16μg/mL、32μg/mL,最低杀菌浓度分别为64μg/mL、128μg/mL,对白色念珠菌最低抑菌浓度为64μg/mL,最低杀菌浓度为128μg/mL;动态抑菌实验显示,1/4倍MIC的氨苄西林组在1 h以后,大肠杆菌和金黄色葡萄球菌开始有生长的趋势,相较之下,在1/4倍MIC的浓度下,发现各抗菌肽组在3 h以后,才陆续开始有生长的趋势,说明抗菌肽处理组都能够更好地延缓微生物的生长;时间-杀菌曲线显示,在2倍MIC的抗菌肽处理后,五条抗菌肽在作用的一开始就立即进行杀菌,菌落数显著减少,随着时间的增加,杀菌速度逐渐减弱,曲线呈平缓趋势;盐稳定性实验显示,在PBS中,相同浓度的多肽处理大肠杆菌、金黄色葡萄球菌,抗菌活性显著降低;酶解稳定性实验显示,所有的抗菌肽在被胰蛋白酶处理1 min后,都大大降低了抑菌活性。这说明本研究所设计的五种抗菌肽都容易被胰蛋白酶分解,降低了原本的活性。本研究通过设计小分子AMPs,筛选获得有抗菌活性的AMPs五条,其中存在一条对细菌、真菌均具有良好的抗菌活性,为新型多肽类抗菌物质的设计与研究奠定良好基础。
【图文】：

氨基酸组成,抗生素耐药性,细菌膜,抗生素抗性

世界卫生组织已经发布了一份“优先病原体”清单，其中包几乎没有有效的治疗方案[7]。预计至本世纪中叶，倘若再无全的死亡病例每年将超过 1000 万次[8,9]，因此，急需研发一种品。microbial peptides，AMPs）是地球上几乎所有的有机体，由生的一种天然非特异性免疫防御的物质。例如当昆虫受到外）后需对全身进行自我防御，主要于体内的脂肪体（功能类最终分泌到血淋巴中来达到自身免疫效果。阳离子 AMPs 广]。AMPs 的长度、结构和氨基酸组成极不均匀，国内外科学理化性质及抗菌活性进行深入研究与探索，最终证实一般的基，所有 AMPs 都具有相似的氨基酸组成，其特征在于具有氨基酸[11]，基于此结构基础保证了 AMPs的诸多优良特性。且病毒和抗真菌，不容易诱导细菌产生耐药性，生物毒性低，，正电荷能够与细菌膜表面负电荷间发生静电吸附，其疏水组其膜结构，最终使内外渗透压失衡死亡[13]（如图 1-1 所示）合以及病原菌中多种抗生素抗性的传播使得 AMPs 成为常规，它的开发为解决传统抗生素耐药性问题提供了一个新的方具有极其广阔的前景。

模型图,桶板,模型,地毯

a.桶板模型 b.地毯模型 c.环形孔模型 d.无序模型图 1-3 膜作用通道示意图[23]Fig.1-3 Membrane channel model模型3 中 a 所示，AMPs 首先附着于脂质膜表面，其轴平行于脂质膜表质双层的疏水核心对齐，导致形成永久性跨膜孔。肽的亲水区构此自组装或相互作用以形成结构排列，其看起来像空心圆柱体，杆菌肽 S 就是通过桶板模型发挥抑菌作用的[23]。模型提出 AMPs 的膜分解活性是由于膜脂质变成小聚集体。如图 1-3 中基团作用形成一种地毯状，并平行排列于膜表面，引起堆积的脂体，最终使膜结构不完整，进而胞内物溢出。在抗菌活性期间没征。高 P：L（肽与脂质）比例的阳离子肽就是通过这种作用机制孔模型
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S433.5

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