马蜂柑响应黄龙病菌侵染前期与后期的转录组和蛋白组学研究

发布时间：2020-05-13 19:54

【摘要】：柑橘黄龙病是一种具有百年历史的柑橘病害,该病害传播流行快,为害区域广,目前尚无有效的治疗方法。黄龙病的病原是韧皮部杆菌属的三种革兰氏阴性菌,根据它们首次被发现的地点命名为“Candidatus Liberibacter asiaticus”(CLas,亚洲种)、“Candidatus Liberibacter africanus”(CLaf,非洲种)和“Candidatus Liberibacter americanus”(CLam,美洲种)。黄龙病菌可通过嫁接和三种木虱(Diaphorina citri,Trioza erytreae and Cacopsylla citrisuga)传播,迄今没有发现有效分离培养这些细菌的方法。目前,所有的商业化柑橘种植品种都是黄龙病敏感寄主。前期通过生物学鉴定、PCR检测和比较转录组学研究,表明马蜂柑对黄龙病可能具有一定的耐病性。本研究对感染黄龙病前期(接种CLas 4个月)和后期(接种CLas 14个月)的马蜂柑进行转录组测序和蛋白组定量分析,从中选取部分差异表达基因进行qPCR验证,以期从基因水平和蛋白水平解析马蜂柑对CLas侵染的应答机制。所获得的主要研究结果如下:1.为进一步提高检测灵敏度,本研究建立了柑橘黄龙病菌亚洲种微滴式数字PCR(Droplet digital PCR,ddPCR)检测方法,该方法准确灵敏,可进行绝对定量,其检测灵敏度比实时荧光定量PCR高100倍。通过生物学症状和显微结构观察发现,不论是感病前期还是后期,马蜂柑几乎不显症,其显微结构与健康植株相比无明显差异,表明马蜂柑对黄龙病可能具有潜在的耐病性。2.对感染前期和后期的马蜂柑进行了转录组测序,筛选出耐病相关的差异表达基因并进行了RT-qPCR验证。结果表明,马蜂柑感染黄龙病前期共181个基因差异表达,其中32个上调,149个下调,马蜂柑感染黄龙病后期共1384个基因差异表达,其中386个上调,998个下调。通过差异表达基因表达趋势分析发现,从健康-感病前期-感病后期的过程中,显著性富集的趋势有2种,分别呈现先下降后上升和先上升后下降的趋势。呈趋势差异表达的基因进行KEGG富集分析,发现呈趋势表达的通路有苯丙素生物合成、单萜类生物合成、淀粉和蔗糖代谢、植物激素信号转导、植物-病原菌互作等,表明在CLas胁迫下,马蜂柑可能通过调节激素代谢水平、合成次生代谢物质(如黄酮、木质素、酚类化合物等)和抗病相关蛋白来制造物理或化学障碍,以限制CLas的定殖及进一步扩展。感病前期淀粉合成及降解相关基因协同下调表达,后期编码胼胝质合成酶的基因上调但倍数不高,PP2蛋白相关基因表达无明显差异,表明马蜂柑在CLas侵染后受影响不大。RT-qPCR验证结果表明,25个基因中,22个基因的验证结果与RNA-seq测序结果的变化趋势一致,表明测序结果的可靠性和准确性。3.对感染前期和后期的马蜂柑进行了iTRAQ蛋白组定量分析。结果表明,马蜂柑感染黄龙病前期共378个蛋白差异表达,其中232个上调,146个下调,马蜂柑感染黄龙病后期共488个蛋白差异表达,其中172个上调,316个下调。通过差异表达蛋白KEGG Pathway富集分析发现,马蜂柑感病前期显著富集的通路有植物-病原菌互作、硫代谢、倍半萜和三萜生物合成、双萜生物合成等。马蜂柑感病后期显著富集的通路有泛素介导的蛋白水解、磷脂酰肌醇信号系统、苯丙素生物合成等。马蜂柑感病前期差异表达蛋白涉及的代谢途径及差异蛋白数量较后期少,且整体呈上调趋势,后期呈下降趋势。与转录组相关联的差异蛋白有56个,其中与差异基因表达趋势相同的有45个。多数差异蛋白参与了植物的抗逆响应,如苯丙氨酸解氨酶、谷胱甘肽S-转移酶、神秘果类蛋白、GDSL脂解酶、过氧化物酶、过氧羟基脂肪酸羟化环氧化酶、纤维素合酶、大根香叶烯D合酶、伸展蛋白和植物凝集素等。
【图文】：

琼脂糖凝胶电泳,测序,带序,片段

图 3.1 PCR 扩增琼脂糖凝胶电泳图M： 2000 bp 分子量 marker； 1-4：样品； 5：负对照； 6：水Fig. 3.1 Agarose gel electrophoresis of PCR productM： 2000 bp DNA marker； 1-4： Samples； 5： Negative control； 6： Water.胶纯化后 PCR 产物与 pEASY -T1 载体连接，转化 Trans1-T1 大肠杆菌 PCR 验证结果显示，所获片段大小为 76bp，与目标大小一致（图 3.部分阳性克隆送上海英潍捷基公司测序。测序结果经 Blast 分析所扩带序列与 CLas 序列同源性为 100%，表明所扩增条带为目的片段。

菌液,测序

图 3.1 PCR 扩增琼脂糖凝胶电泳图M： 2000 bp 分子量 marker； 1-4：样品； 5：负对照； 6：水Fig. 3.1 Agarose gel electrophoresis of PCR productM： 2000 bp DNA marker； 1-4： Samples； 5： Negative control； 6： Water.胶纯化后 PCR 产物与 pEASY -T1 载体连接，转化 Trans1-T1 大肠杆 PCR 验证结果显示，，所获片段大小为 76bp，与目标大小一致（图部分阳性克隆送上海英潍捷基公司测序。测序结果经 Blast 分析所带序列与 CLas 序列同源性为 100%，表明所扩增条带为目的片段。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S436.66

【相似文献】