盾壳霉产孢、寄生和维持渗透相关基因CmSMT1的功能研究

发布时间：2020-05-15 03:50

【摘要】：盾壳霉(Coniothyrium minitans)是一种寄生核盘菌的重寄生真菌,对作物菌核病具有显著的生物防治效果。目前,市场上已有商品化盾壳霉制剂投入使用。研究盾壳霉生长、产孢和寄生相关机制,可望提高盾壳霉的生物防治效率。实验室在前期研究中分离鉴定出一株生长、产孢及寄生菌核等方面均显著下降的T-DNA插入转化子ZS-1TN11990,发现T-DNA插入可能破坏了盾壳霉中编码甾醇C-24甲基转移酶(sterol C-24 methyltransferase)的基因(CmSMT1)。本研究旨在前期研究的基础上,进一步研究盾壳霉基因CmSMT1的生物学功能,研究结果如下:通过比较盾壳霉的基因组数据库发现CmSMT1的全长为1220 bp,包含2个内含子和3个外显子,推定编码358个氨基酸。通过比对NCBI蛋白数据库,发现该基因编码的蛋白含有1个Methyltransf_25保守结构域,在C端含有1个Sterol_MT_C保守结构域。Real-time PCR检测发现,CmSMT1在盾壳霉中于PDA上生长72 h时表达量最高。利用分割标记法敲除了盾壳霉的CmSMT1,获得其敲除转化子。研究发现敲除转化子与野生菌株存在显著的差异。与T-DNA插入转化子的表型类似,敲除转化子在PDA上形成的菌落为白色,不产生分生孢子器和分生孢子,生长速率与生物产量显著降低,活性氧含量升高;CmSMT1敲除转化子对山梨醇、甘油和氯化钠高渗培养基敏感性显著增强,表明该基因与维持细胞渗透的平衡相关;突变体寄生核盘菌菌丝和菌核的能力均显著降低。构建了CmSMT1的互补载体,通过农杆菌介导盾壳霉技术获得互补转化子,互补转化子均能恢复以上表型。表明CmSMT1与转化子的不正常表型相关。对野生菌株ZS-1与敲除转化子的次生代谢产物进行LC-MS分析比较,发现两个敲除转化子的总离子流图趋势一致,敲除转化子KO-CmSMT1-1与KO-CmSMT1-2相对于ZS-1分别存在6550个差异代谢组分和6835个差异代谢组分。在p-value≤0.01,fold change≥2的条件下,敲除转化子KO-CmSMT1-1相对于ZS-1存在534个显著差异代谢组分,显著上调的差异代谢物有361个,显著下调的差异代谢物有173个;KO-CmSMT1-2相对于ZS-1存在1128个显著差异代谢组分,显著上调的差异代谢物有975个,显著下调的差异代谢物有153个。两组数据进行成对差异比较得到379个共有的显著差异代谢组分。进一步利用系统生物学预测分析了KO-CmSMT1-1和KO-CmSMT1-2的代谢数据,发现与麦角甾醇生物合成途径密切相关的代谢物(2E,6E)-法呢基二磷酸酯和二甲基烯丙基二磷酸酯的含量显著下降;另外还发现与生物体活动相关的代谢物吡哆醛5'磷酸和4-氨基-2-甲基-5-二磷酸甲基嘧啶含量显著下降,但核黄素在这两个敲除转化子中的含量则显著提高。以上结果表明CmSMT1对盾壳霉的正常生长、发育和寄生等生命活动至关重要;敲除CmSMT1盾壳霉合成(2E,6E)-法呢基二磷酸酯和二甲基烯丙基二磷酸酯的能力显著下降,从而影响麦角甾醇的合成;而积累了大量的核黄素可能是敲除转化子中活性氧增加的原因。
【图文】：

麦角甾醇,生物合成途径,酿酒酵母,颜色表

酒酵母麦角甾醇生物合成途径及其相关基因，不同颜色表示不同的阶段Daum 2014）CoA：辅酶 A；HMG-CoA：3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA；P：磷酸盐，LD 脂滴The ergosterol pathway and related gene in Saccharomyces cerevisiae, differeindicates different modules. (Klug and Daum 2014)A: Coenzyme A; HMG-CoA: 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA; P: phosphate, LD: lipid d角甾醇的生物合成的是一个多酶参与催化的极为复杂的过程，为例，如图 1.1 所示，，在酿酒酵母中至少经过 20 多步的反应lug and Daum 2014）。目前，麦角甾醇的生物合成途径一般为三羟戊酸生物合成，以乙酰辅酶 A（acetyl-CoA）为原料，到形在酿酒酵母中，第一阶段的相关基因是生长必需的，敲除致死、高等植物以及微生物中都较为保守。该阶段涉及 ERG10 基

原理图,原理,潮霉素基因,同源重组

华中农业大学 2019 届硕士研究生学位（毕业）论文5 盾壳霉 CmSMT1 的基因敲除及验证5.1 同源重组的原理源重组的原理如图 2.1 所示，通过融合 PCR 扩增，获得目标基因的与潮霉素基因序列的融合产物（UHY）以及目标基因的下游序列 D 与列的融合产物（YGD），然后通过 PEG 介导的转化将融合产物导入盾中，根据三重同源重组，潮霉素基因替换掉目标基因，从而获得目标化子（Yu et al 2004）。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S476

【参考文献】