解淀粉芽孢杆菌LXY-6-2筛

发布时间：2020-05-15 10:33

【摘要】：辣椒根腐病是由疫霉菌和镰刀菌引起的,其中镰刀菌有腐皮镰孢霉(Fusarium solani)、蚀脉镰孢(Fusarium vasinfectum Atk.)等。由于多年连续种植,且长期携带并传播病毒的休眠孢子具有很强的抗逆性致使辣椒根腐病病害的发生越来越严重。解淀粉芽孢杆菌稳定性强可在土壤中生存20~25年,无法通过栽培措施和杀菌剂清除。利用微生物防治辣椒根腐病,能够减轻化学药剂对生态环境的危害,是防治植物病害的一种环保、安全、高效、可持续的手段。本研究前期从实验室保藏的由秦岭深山原始森林不同海拔高度落叶层密集的地区土壤中采集并进行分离与筛选后得到的具有广谱杀菌活性的10株菌株LXY-1~LXY-10。以水稻稻瘟病菌Magnaporthe oryzae、番茄灰霉病菌Botrytis cinerea Pers、辣椒根腐病菌Fusarium vasinfectum等作为病原指示菌筛选出具有良好广谱抗性的菌株LXY-6。通过形态学与分子生物学对菌株LXY-6进行鉴定,通过菌落形态、电镜观察及参考《伯杰氏细菌手册》(BuchananGibbons,1984)和《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠和,2001)进行检索,确定菌株LXY-6为芽孢杆菌。再进行16S rDNA鉴定和ITS序列鉴定构建的系统发育树确定菌株LXY-6为解淀粉芽孢杆菌。对筛选鉴定得到的解淀粉芽孢杆菌LXY-6通过紫外、硫酸二乙酯(DES)、亚硝酸(HNO2)三种方法诱变得到4株弱溶血性菌株LXY-6-1~LXY-6-4。通过血琼脂平板培养基筛选弱溶血性的突变菌株,以辣椒根腐病等病原菌测定突变弱溶血性菌株的抑菌活性。其中紫外灯功率40W,距离为20 cm诱变5min,得到的弱溶血性解淀粉芽孢杆菌LXY-6-2溶血性与抑菌活性最好,其抑菌圈直径为24.0±1.76mm,溶血环直径为5.0±1.31mm。并对LXY-6-2世代进行溶血性与抗性检测,证明LXY-6-2具有稳定的弱溶血性及抑菌活性。对LXY-6-2采用单因素变量分析法以活菌数与抑菌直径为判断标准进行发酵条件的优化。确定培养进行到20~23 h为菌株LXY-6-2最适接种种龄、蔗糖最佳碳源、酵母浸粉为最佳氮源、PH=7、28°C-32°C为最适PH与温度、最佳接菌量为孢悬液与液体培养基的体积百分比8%-10%、最佳摇床转速为220r/min。以优化后的培养条件培养LXY-6-2,48h后测得活菌数为(8.9±1.13)×10~8孢子/mL,抑菌圈直径为(29.53±1.32)mm。较基础培养基的活菌数与抑菌直径均有提高,优化效果明显。本研究将LXY-6-2发酵液与50%多菌灵可湿性粉剂、50%苯菌灵可湿性粉剂、甲基硫菌灵悬浮剂进行辣椒根腐病的防效对比。得到结论LXY-6-2发酵液的防治效果较好,末次施药15d后达到68.40%。且LXY-6-2发酵液灌根48h后接种辣椒根腐病病原菌孢悬液处理在接菌后7d、14d、21d后的防治效果最高。证明用LXY-6-2防治辣椒根腐病时应将LXY-6-2提前施用,对辣椒根腐病具有预防效果。LXY-6-2发酵液对辣椒根腐病具有较好防治效果,且安全环保,具有较高的经济效益和研究应用价值。
【图文】：

病原菌,禾谷镰孢,抑制率,小麦根腐病菌

图 2-1 部分拮抗菌筛选结果Fig.2-1Re-screening results of FungusA. LXY-6 与稻梨孢霉( Magnaporthe oryzae)对峙图B. LXY-6 与灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea Pers.)对峙图C. LXY-6 与禾谷镰孢(Fusarium graminearum Schw.)对峙图上拮抗效果较好的菌株 LXY-2、LXY-5、LXY-6、LXY-7、LXY-1稻瘟病菌、小麦根腐病菌、棉花枯萎病菌、番茄灰霉病菌、小麦赤菌进行拮抗活性测定，对病原菌的抑制率见表 1。可知 LXY-6、LXY较高，其中 LXY-6 对六种病原菌的抑制率最高，在 78%-94%。其率达到 94.98%。12

菌落形态,菌落形态,菌株

ddH2O 17.25μL。条件 95 ℃5 min，（95 ℃ 30 s，，55℃ 1 min，72℃）30 个循环，72 ℃ 5 min PCR 产物经 1%琼脂糖凝胶（0.2 g 琼脂糖+20 mL1%液+2 μL 核酸染料）电泳检测，PCR 产物送测序公司测序。（上海生工生物工司）2.3 数据处理将测得的序列在 GenBank 中进行 BLAST 核酸序列比对，通过 MEGA6.1 等进分析，并使用软件中 Construct Neighbor -joining Tree 法构建系统发育树进行分结果与分析1 形态学鉴定LXY-6 菌株利用梯度稀释法得到SX孢菌落，在 LB 平板上生长时菌落呈乳白色干燥粗糙有褶皱，菌落扁平，边缘呈现锯齿状，革兰氏阳性菌。（见图 3.1）光学显微镜和扫描电镜对菌种进行观察，菌株呈杆状单生，周生鞭毛。（见图 LXY-6 的生理生化特性试验（见表 3.1）并结合该菌株的形态特征，初步鉴定 L为芽孢杆菌属。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S476;S436.418

【参考文献】