漆酶GhLac1介导棉花广谱抗性的机制解析

发布时间：2020-05-16 06:51

【摘要】：生长在自然环境中的植物,无时不刻都在遭受着病原菌和植食性昆虫的侵害。在长期的共进化和互相选择的过程中,植物建立起了一个复杂而精密的调控网络去感知和响应不同的生物胁迫类型,并迅速的激活植物体内相应的应答路径,在转录水平、蛋白水平和代谢水平上建立起新的生理生化平衡。在大田环境中,多种病虫害并存,提高植物的广谱抗性能力才能适应复杂多变的自然环境。本研究从棉花原生质体细胞壁重建的抑制消减杂交文库中克隆了一个能够促进细胞壁合成的基因GhLac1,并对其在介导棉花广谱抗性中的作用机制进行了研究,取得的主要结果如下:1.鉴定到受多种处理诱导的漆酶基因GhLac1。通过对陆地棉品系YZ1原生质体细胞壁重建的抑制消减杂交文库进行分析,发现了3条与GaLAC1(Gossypium arboretum secretory laccase,GI:40218370)具有较高同源性的EST(expressed sequence tag)序列(GI:213047554,GI:213047555和GI:213047556)。对这3条EST序列进行表达模式分析,发现GI:213047556受黄萎病菌、茉莉酸和H_2O_2诱导上调表达最为显著。因此,我们克隆了陆地棉GI:213047556的全长并命名为GhLac1。GhLac1编码一个含有566个氨基酸的蛋白,且含有植物漆酶典型的铜离子结合位点,以及N端分泌蛋白信号肽。进化分析表明,Gh Lac1与来源于可可的漆酶TvLac(GI:590604253)相似性最高。组织表达模式表明GhLac1在根系中表达量最高,其次是叶片。2.超量表达GhLac1能够促进木质素合成并增强棉花的广谱抗性。为了验证GhLac1在棉花中的功能,我们构建了烟草花叶病毒35S启动子驱动的GhLac1超量表达(35S::GhLac1)和RNAi抑制表达(35S::RNAi GhLac1)载体,并获得了相应的超量表达株系(OL-12、OL-13和OL-56)和RNAi抑制表达株系(iL-1和iL-11)。后续研究发现,GhLac1超量表达材料中木质素含量增加,这与已报道的植物漆酶能够促进木质素单体聚合的功能相吻合。抗性鉴定表明,超量表达GhLac1提高了转基因棉花对黄萎病菌、棉铃虫和棉蚜的抗性。3.抑制GhLac1表达能够促进棉花黄酮类次生代谢物及茉莉酸合成并增强转基因材料对黄萎病菌和棉铃虫的抗性。在抑制GhLac1表达后,转基因材料的木质素含量减少,但是苯丙烷代谢路径上游基因的表达水平和蛋白酶活明显增加。后续实验也证实了,在GhLac1抑制表达材料中总黄酮的含量增加,并具有抑制黄萎病菌和棉铃虫生长的作用。此外,我们还发现在GhLac1抑制表达材料中,茉莉酸和茉莉酸异亮氨酸含量增加,茉莉酸介导的信号路径组成性激活。因此,抑制GhLac1表达增强棉花对黄萎病菌和棉铃虫抗性增强可能与黄酮等次生代谢物的积累和茉莉酸信号路径的组成性激活有关。4.抑制GhLac1表达导致棉花对棉蚜的敏感性。对GhLac1抑制表达材料进行蚜虫接种鉴定,结果表明,与对照材料相比,转基因材料更感蚜虫。这可能是由于抑制GhLac1表达导致转基因材料中木质素含量减少,有利于蚜虫口器的刺入,方便蚜虫的取食;此外,在GhLac1抑制表达材料中,由于茉莉酸信号路径组成性激活间接抑制了在抗蚜虫中具有重要作用的水杨酸信号路径,因而导致GhLac1抑制表达材料更感蚜虫。5.GhLac1抑制表达材料中茉莉酸含量增加依赖于细胞壁多糖含量的增加。病原菌入侵或植食性昆虫取食造伤的细胞壁损伤,会造成胞壁区间内细胞壁多糖含量的增加,而位于细胞膜上的相关受体能够识别这种多糖信号并激活植物免疫系统。细胞壁多糖含量测定表明,与对照材料相比,GhLac1抑制表达材料中水溶性和EDTA溶解性细胞壁多糖含量最高,而GhLac1超量表达材料中含量最低。用转基因材料和对照材料的水溶性细胞壁多糖处理棉花悬浮培养细胞系,也证实了这种水溶性多糖能够促进茉莉酸的合成,且茉莉酸的含量和处理时所用水溶性多糖含量正相关。因此,我们推测GhLac1抑制表达材料中茉莉酸含量增加是由于木质素含量减少,细胞壁结构松弛,导致水溶性和EDTA溶解性细胞壁多糖含量增加并激活了植物体内茉莉酸合成路径。
【图文】：

先天免疫,病原微生物

并且兼顾了对病原微生物抗性的广谱性和专化性。广义上，植物原物的抗性可分为非寄主抗性和寄主抗性 (Lipka et al., 20eimer-Michalski et al., 2016)。非寄主抗性是植物的主要抗病类型，具有广谱定持久的特点，不易随着病原微生物的进化变异而丧失，这也是为什么自然虽然存在着大量的病原微生物，，植物只对少部分的微生物表现出敏感性的原Gill et al., 2015; Lee et al., 2017; Mysore et al., 2004)。相对于非寄主抗性，人们的更多的是寄主抗性，从植物如何感知病原物的入侵，如何激活并放大植物的信号转导，到如何积累物理的、化学的抗性物质都进行了深入的研究。在与病原微生物长期的共进化中，植物形成了 2 个层面上的免疫反应：一是病关分子模式（pathogen-associated molecular pattern, PAMP）或者损伤相关分式（ damage-associated molecular pattern, DAMP ）诱发的免疫反Pattern-triggered immunity）PTI；另外一个是效应子（effector）诱发的免疫（effector-triggered immunity）ETI（图 1.1）(Dodds et al., 2010; Xu et al., 2017

模型图,模式识别受体,植物,模型

图 1.2 常见的植物模式识别受体模型（引自 Macho et al., 2014）。Fig. 1.2 Various types of plasma membrane localized pattern recognition proteins (Macho et al.,2014).在植物与病原物协同进化的过程中，病原菌为了突破植物的 PTI 免疫达到入侵植物的目的，会进化出一类致病能力更强的效应子，这些效应子能够干扰植物的 PTI 反应，从而抑制植物的基础免疫。植物为了突破病原微生物效应子导致的免疫抑制，会进一步进化出针对特定效应子的 R 基因（resistance gene），随后病原菌也会进化出新的效应子突破植物的免疫反应，如此循环。这也是目前所公认的植物与病原物共进化的‘zigzag’模型（图 1.3）(Jones et al., 2006)。R 蛋白能够识别病原微生物的效应蛋白，从而激活下游的 ETI 反应，同时伴随着超敏反应（hypersensitive reaction）的产生，在侵染部位造成局部性细胞坏死以限制病原菌的扩展。因此，相对于 PTI，ETI 反应更加迅速和特异，反应也更为剧烈，类
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S435.62

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