番茄青枯病拮抗内生放线菌的分离及抗菌活性产物研究

发布时间：2020-05-18 10:46

【摘要】：番茄青枯病的病原菌是茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum),可以侵染200多种植物。由于病原菌可以长期存活在土壤、水中以及被侵染的植株内,一旦有机会随时会感染新的植株,因此发病率较高,难以进行防治。番茄作为农业主要的经济作物,因遭受青枯病的危害导致每年产量严重下降。目前对于青枯病的防治主要以化学农药为主,但由于化学农药长期使用导致宿主植物的抗药性有所提升而且对环境造成了严重的影响。因此,农业生产迫切需要研制新型、低毒和无害的防治青枯病的抗生素。本文主要通过筛选青枯病拮抗菌,以及对拮抗菌次生代谢产物进行分离,为番茄青枯病的生物防治提供了新型的拮抗菌和抗菌活性物质。本研究选取了5种常用的筛选培养基对健康和感染青枯病的番茄植株根内内生放线菌进行筛选,将得到的放线菌进行重复合并、菌属归类、菌株种类统计和菌株丰富度分析。测试分离得到的菌株对番茄青枯病病原菌的抑菌活性,筛选对番茄青枯病具有抑制作用的拮抗菌,对拮抗作用较强的菌株进行发酵液活性的测试和次生代谢产物的分离,并且对它们进行了形态特征的描述。此外,本实验还对从根内分离得到的两株野野村新种进行了多相分类学分析,为稀有放线菌的分类学提供了新的资源。实验结果如下:(1)我们从健康和染病的番茄植株根内共分离得到1465株放线菌,去除重复后,合并为256株不同的放线菌,其中只存在于染病根内的内生放线菌有85株,只存在于健康根内的放线菌有49株,另外的122株在染病和健康的番茄植株根内都存在。通过对菌株丰富度和种类分析发现,健康番茄植株根内分离的放线菌丰富度高于染病植株根内内生放线菌;而染病植株根内内生放线菌种类上多于健康植株分离得到的放线菌;健康和染病番茄植株根内有大量共存的放线菌。(2)对分离得到的256株菌测试了对青枯病病原菌抑菌活性,得到23株有抑菌活性的内生放线菌,其中有7株放线菌分离自健康番茄植株,抑菌直径在17.64±0.72-22.04±0.42 mm之间,13株放线菌分离自染病番茄植株根内,抑菌直径大小在18.54±0.87-28.06±1.32 mm之间,3株放线菌在染病植株和健康植株中均存在,抑菌直径大小在17.86±1.86-20.12±1.75 mm之间。发现对青枯病原菌抑制作用较强的两株菌NEAU-JGH122(分离自健康番茄植株)和NEAU-BGG209(分离自染病番茄植株)对其他两种病原细菌也存在抑制作用,同时也检测到菌株NEAU-BGG209对8种病原真菌具有抑菌活性。(3)通过16S rRNA测序分析和形态培养特征确定菌株NEAU-BGGG209和NEAU-JGH122均属于链霉菌属。(4)对菌株NEAU-BGGG209和NEAU-JGH122的次级代谢产物进行分离,其中NEAU-BGG209得到了三种化合物分别为腐殖酸类似物4,5-dimethoxybenzene-1,3-diol、亚胺类化合物9-methylstreptimidone和聚醚类化合物methylgrisorixin。NEAU-JGH122分离得到两种化合物5-prenyltryptophol和nocardamines。化合物Methylgrisorixin,5-prenyltryptophol和nocardamines对番茄青枯病有抑制作用。检测到它们分别在浓度≥0.08 mg/mL、10 mg/mL和2 mg/mL对番茄青枯病表现出抑制作用。(5)采用多相分类学法鉴定两株新菌NEAU-DE8(1)~T和NEAU-HE1(2)。菌株NEAU-DE8(1)~T和NEAU-HE1(2)的16S rRNA基因相似度高达99.6%,这两株菌的形态特征和化学成分特征及其相似,判定它们可以代表同一株菌,生理生化特征用来区分这两株菌及它们的相似菌。另外DNA同源性分析结果表明,菌株NEAU-DE8(1)~T和NEAU-HE1(2)与它们相似菌的DNA杂交低于70%,从而确定了菌株NEAU-DE8(1)~T和NEAU-HE1(2)代表野野村菌属的一个新种,命名为Nonomuraea lycopersici。
【图文】：

青枯病,农作物,病原菌,研究概况

种植的农作物之一，在全世界的栽培面积居各类蔬菜之首[5]，然而，番从而大幅度降低了番茄产量。病研究概况病病原菌介绍菌 Ralstonia solanacearum，Ralstonia pseudosolanacearum 和 Ralstonesiensis[6]都可引发青枯病，其中 R.solanacearum 是番茄青枯病最为常见到青枯病原菌指的是 R. solanacearum，而后两种名称应用较少。近些复杂，青枯病原菌（R. solanacearum）分别根据生理生化特征[7]、宿子生物学[9]三方面特征将病原菌分为 5 个突变种（biovars），5 个生理小类型（phylotypes）如图 1-1。我国的青枯病类型主要是 Race 1 中的 b目前为止，青枯病原菌能感染 200 多种植物，主要包括茄科农作物和观赏作为重要的农作物每年遭受青枯病的迫害尤为严重。番茄青枯病是世植物病原菌之一[10]。据相关文献报道，青枯病发病最为严重时，可以和马铃薯减产 90%，烟草减产 30%以及花生减产 20%[11]。

放线菌,单位,内生放线菌,植株

结果与分析分析线菌的群落结构组成用的放线菌筛选培养基（SSA、CPA、DPA、GS 和 HV）对放线菌进行筛选，每种培养基五个重复，通过平板计数法 3-1，可看出健康样品根内内生放线菌的整体数量高于染病重复菌株进行合并，合并后得到了 256 种不同的放线菌，其菌有 49 种，只存在于染病植株根内的放线菌有 85 种，染病有 122 种（图 3-2，3-3 和 3-4）。染病植株和健康植株共存番茄植株在感染青枯病后，内生放线菌在一定的程度上维持和健康植株特有的菌株，，体现了染病后根部微环境的的动态
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S436.412.15;S476

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