西萌芦ZYMV病毒抗性的转录调控研究

发布时间：2020-05-19 12:22

【摘要】：西葫芦(Cucurbita pepo L.)是世界范围内广泛栽培的重要蔬菜,我国年均栽培面积及产量均居世界前列,且仍呈逐年增加的趋势,现已成为农民增收及农村产业结构调整的重要支柱。但目前生产中受病毒病危害严重,其中小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV)是危害西葫芦等瓜类蔬菜的主要病害之一。西葫芦植株感染ZYMV后产生花叶、扭曲、植株矮化畸形,果实瘤状凸凹不平、果肉僵硬苦涩等症状,导致果实的商品性状降低甚至丧失,产量损失可达60%以上,甚至绝产,造成巨大经济损失。培育抗病品种是防治病毒病最经济、安全、有效的方法,而西葫芦抗病毒育种研究滞后,可利用的抗性资源较少,导致生产上缺乏抗病毒病西葫芦品种。因此,本研究拟利用转录组测序筛查西葫芦ZYMV病毒病抗性相关基因,将有助于发掘和合理评价利用抗病遗传资源,为西葫芦抗病毒分子育种提供基因储备,保障西葫芦安全生产,也为病毒病抗性分子机理解析提供理论支持。利用苗期人工接种鉴定,我们筛选获得了高抗与高感ZYMV的西葫芦自交系材料,并对西葫芦ZYMV抗病遗传规律进行了解析。对抗、感材料ZYMV病毒接种诱导后提取总RNA,利用Solexa高通量测序技术进行转录组测序,并对获得的转录组数据进行生物信息学分析,筛查了ZYMV诱导抗病相关基因,并进一步对病毒诱导基因进行了表达谱分析,获得主要研究结果如下:1、获得高抗与高感ZYMV的自交系材料建立了西葫芦ZYMV病毒病苗期人工接种鉴定评价体系,通过对二百余份西葫芦种质材料进行苗期ZYMV病毒接种和性状鉴定,获得6份高抗材料和10份高感材料。2、西葫芦ZYMV抗性性状由一对显性基因控制以高抗自交系CPZR1和高感自交系CPZS1作为亲本,配制了六世代分离群体,利用子叶摩擦接种方法接种两次ZYMV病毒,进行抗、感性状鉴定。结果表明,各世代中抗、感植株的分离比例符合孟德尔理论分离比,西葫芦ZYMV抗性性状由一对显性抗病基因控制。3、转录组测序获得12G以上的高质量测序数据以抗、感自交系为病毒接种材料,以无病毒缓冲液摩擦接种为对照处理。接种24个小时之后,分别取抗病与感病材料的病毒诱导处理与空白缓冲液诱导处理(对照)的真叶提取总RNA,形成4个样品池。建库后进行高通量转录组测序,分别获得了3G以上的高质量测序数据。西葫芦转录组GC含量47%左右,Unigene 73148条,平均长度582.6 bp,长Unigene(≥1K)11108条。并对Unigene进行了编码区预测、蛋白序列分析、功能注释以及表达丰度分析;获得两份材料间可靠SNP位点2287个,SSR位点4129个。4、获得ZYMV抗病相关候选基因33个抗、感材料间ZYMV病毒诱导的差异表达基因有402个(表达量差异1倍以上);抗病材料在病毒诱导与对照处理间差异表达基因有104个。经对差异表达基因的聚类分析、功能注释、处理间表达量比较等分析后筛选获得候选ZYMV抗病相关基因33个,主要涉及病程相关基因、细胞壁形成因子、ATPase亚基编码基因以及生长素相关基因等。利用qPCR对其中15个基因的表达谱进行分析验证,证明了转录组测序结果的可靠性,并进一步明确了这些基因在病毒诱导不同时间的表达特点。5、构建了两个基因的RNAi及植物过表达载体利用RACE技术克隆了2个候选抗病相关基因(CpGp1与CpPr1)的全长序列,并构建了两个基因的RNAi及植物过表达载体。
【图文】：

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河北工程大学硕士学位论文后撒少量 600~800 目金刚砂进行摩擦接种，以缓冲液摩擦接种健康西葫芦幼苗作阴性对照，25℃~30℃无虫条件下培养。（3）分级标准：参照 Provvidenti教授（1987）制定的分级标准。2.1.2.2 西葫芦 ZYMV 病毒病性状鉴定ZYMV-CH病毒病性状鉴定：接种 10-15 天后进行植株抗病性调查，共分为 6级：0 级，植株无症状；1 级，植株有 1~2 片叶明脉；2 级，，少数叶片轻度花叶，形态正常；3级，多数叶片花叶，形态正常，个别叶片畸形；4 级，多数叶片严重花叶，新叶畸形；5 级，几乎所有叶片严重花叶、畸形或植株矮化。2 级以上包括2级视为感病（图 2-1A）。病情指数 DI=( 级别×株数）×100/(总株数×6）。A B

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图 2-2 高抗与高感 ZYMV 的西葫芦材料Fig. 2-2 High-resistance and high-sensitivity ZYMV materials of Cucurbita pepoA：抗病材料；B：感病材料；C：抗病植株叶片；D：感病植株叶片A:Disease resistant materials ; B:Sensitive material ;C:Disease resistant plant leaves ; D:Sensible plant leaf在双亲 CPZR1和 CPZS1，以及两者构建的遗传群体 F1群体、F2群体BC1CPZR1 群体和 BC1CPZS1 群体材料中，亲本 CPZR1和 CPZS1分别表现为抗和感病；CPZR1×CPZS1的 F1均表现为抗病；在 F2群体中，抗病植株有 889 株感病植株有 283 株，经卡方检测，抗病植株和感病植株的分离比为 3：1（表1），符合孟德尔遗传规律。BC1CPZR1 群体有 96 株，均表现为抗病性，BC1CPZS1 群体中，抗病植株有 53 株，感病植株有 45 株，经卡方检测，抗病株和感病植株的分离比例为 1：1（表 2-1）。综合以上分析，结果表明西葫ZYMV 抗性性状由一对显性基因控制，在各世代中抗、感植株的分离比例符合德尔遗传规律理论分离比（表 2-1）。表 2-1 西葫芦 ZYMV 抗性性状遗传分析Table2-1 Genetic analysis of ZYMV resistance traits in Zucchini群体抗病单株感病单株抗感比理论值 χ2 P
【学位授予单位】：河北工程大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S436.429

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