可提高本氏烟基础抗性的半夏异源抗性基因的筛选及功能研究

发布时间：2020-05-27 04:59

【摘要】：非我识别是引发多细胞生物(包括植物)先天免疫反应的重要现象之一。本研究表明非我识别的有效利用可引起植物对病害的持久抗性。本研究不仅成功鉴定了来自传统中药材半夏(Pinellia ternata(Thunb.))的可引起烟草超敏反应的基因,还将这些基因通过遗传转化导入到本氏烟(Nicotiana benthamiana Domin)中,增强了本氏烟对三种不同病原物(灰霉(Botrytis cineria)、辣椒疫霉(Phytophthora capsici)和烟草花叶病毒(TMV))的基础抗性。本研究利用p TRV表达载体构建了半夏的c DNA文库,并转入到根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105中。利用农杆菌介导的瞬时表达系统,初步筛选到了49个能引起烟草超敏反应的半夏(pt HR)基因。确认了其在本氏烟、番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)和棉花(Gossypium hirsutum L.)叶片中的强过敏性反应之后,选取了7个基因(pt HR293,pt HR759,pt HR1015,pt HR941,pt HR375,pt HR2-20和pt HR99)做进一步研究。本研究表明,这7个pt HR基因在引起烟草超敏性反应的同时会引发活性氧爆发及胼胝质沉积等现象。将pt HR基因注射本氏烟的上部叶片0-120小时后,病程相关基因(PR-1a,PR-5,PDF-_1.2,NPR1,PAL,RBOHB和ERF-_1)的表达量会以24小时的时间间隔显著升高,显示其可能激活了水杨酸(SA)和茉莉酸/乙烯(JA/ET)介导的防御途径。在本氏烟的上部叶片表达这些pt HR基因0-168小时后,可以以24小时的时间间隔增强抗氧化酶(过氧化物酶(POD),多酚氧化酶(PPO)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性。本研究将选取的pt HR基因克隆到p CAMBIA3301双元表达载体的Bgl Ⅱ和Bst E Ⅱ酶切位点之间,并通过测序分析确认序列的正确插入。将克隆子转化到根癌农杆菌EHA105中后,利用农杆菌介导的遗传转化体系成功获得了7种正常转化的本氏烟植株(pt HR293,pt HR759,pt HR1015,pt HR941,pt HR375,pt HR2-20和pt HR99)。利用基因特异性引物进行的PCR反应进一步证实了转化的本氏烟中目标基因的阳性整合。将阳性植株的种子在MS培养基上用双丙氨膦抗生素进行筛选后,得到了T_1代植株。利用RT-PCR和q RT-PCR检测pt HR基因的表达直至T_3代转化的本氏烟。在转化的本氏烟中,T_3代植株中病程相关基因的转录组水平为非转化植株的1.14至34.02倍,表明了其对下一代的抗性遗传。转化的本氏烟显示出抗氧化酶(POD,PPO和SOD)活性的百分比增加,其值分别高达66.5%,222.3%和134.4%。这些转化的植株还对灰霉(69.83%)和辣椒疫霉(23.08%)表现出高抗性水平。研究结果显示,在本氏烟中引入pt HR基因显示对植株的种子萌发,根和芽的生长没有副作用。UPLC-QTOF-MS分析显示,转化的本氏烟植株中的一些生物活性化合物显著被诱导,可能与抗性增强有关。这些生物活性化合物是pt HR293转化株系中的乙氧唑胺,吡咯烷,二十四烷,3,4-二氯马来酰亚胺,磺胺和2-十一烷酮;pt HR375转化株系中的土霉素,引诱酮,羟哌氟丙嗪,尿囊素,己烯雌酚和1,2-苯并异噻唑-3(2H)-酮;以及pt HR99转化株系中的哌咪清,水杨酸异戊酯,1,3-丁二烯和香茅醛。F-_1代杂交植株(pt HR941-F-_1,pt HR375-F-_1,pt HR1015-F-_1,pt HR941+pt HR375-F-_1和pt HR293+pt HR759-F-_1)是通过将转化的(T_3)与未转化的植株杂交,以及一种基因转化的T_3代与另一种基因转化的T_3代杂交得到的。与它们各自的对照植株相比,这些杂交植株表现出病程相关基因的高表达水平(高达20.01倍)。在抗性分析中发现,这些杂交植株具有稳定的高抗病性,对灰霉和辣椒疫霉的抑制率分别高达42.38%和30.62%。通过本研究可以得出以下结论:异源植物基因可以激发植物对病害的抗性;通过产生F-_1杂交植株,可以获得新的非病原物诱导的抗性;pt HR基因可在SA和JA/ET防御途径中发挥作用,从而激发植物对入侵病原物的抗性。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S567.239;S435.72
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本文编号：2682992