基于基因组特征的苏云金芽胞杆菌多样性研究

发布时间：2020-05-28 02:44

【摘要】：苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)能产生对多种昆虫具有特异高效毒性的杀虫蛋白,在全世界农林业害虫及卫生害虫的防治中发挥了重要作用。除此之外,近年来,Bt一系列其他的功能也逐渐被发现,包括抑制癌细胞活性、抗病杀菌、促进植物生长、合成金属纳米粒子等。而生物的功能多样性是由遗传多样性所决定的,但是现有的基于遗传多样性的分型方法的区分度不能满足对菌株进行有效分型的需求,例如16S rDNA序列多样性分析等。因此本研究基于菌株遗传多样性在多个水平对Bt进行了多样性的分析。首先我们通过对分辨能力以及运算效率等参数的筛选,获得了高效的分型算法;在此基础上建立了一种新的Bt菌株进化分型系统,对Bt菌株进行进化分析。进一步,利用功能基因注释的策略对Bt潜在功能、鞘翅目害虫杀虫活性进行分析,并结合菌株进化分析结果,研究Bt菌株功能进化的特点。主要结果如下:(1)Bt新菌株分型系统的建立及进化分析。首先对有基因组完成图数据的少量Bt菌株样本进行分析,结果表明Bt的变异在染色体上均匀发生。接下来我们利用5种常见的标准血清型亚种(aizawai,kurstaki,israelensis,thuringiensis,morrisoni,共23株)Bt菌株对四种分型方法进行了评估,结果表明,基于保守核心基因碱基序列多样性的分析方法(多位点序列分型MLST和核心基因序列多样性分析SCCGPA)对菌株的分辨能力不够,无法对相同血清型亚种菌株进行有效的分型;而基于基因组组成特征的分析方法(非必需基因位点多样性分析DGCPA和组分矢量法CVT)能够对菌株进行分辨效果较为理想的分型;并且组分矢量法CVT所需要的运算时间远远低于其他分型方法。进一步我们基于CVT建立了Bt菌株进化分型方法,并对190株Bt菌株进行了进化特征以及遗传多样性的分析。(2)Bt可变基因潜在功能进化特征分析。可变基因(非必需基因和特有基因)是菌株功能多样性的遗传学基础。Bt和同属于蜡样芽胞杆菌种群的B.cereus除了在能否产生杀虫基因上具有差异外,其进化及遗传特征极为接近。我们利用功能基因注释的策略对Bt可变基因中潜在功能活性进行了分析,并结合菌株进化分析结果,对Bt潜在功能进化特征进行了研究。首先我们使用泛基因组分析的方法确定了150株Bt菌株及150株B.cereus菌株中的可变基因。结果共鉴定出38,357个基因家族,其中菌株核心基因家族共239个,占总基因家族的0.62%,可变基因家族共有38,118个,占总基因家族的99.38%。接下来我们对鉴定出的这些可变基因进行了功能基因多样性的分析。我们利用序列比对的方法对其包含的杀虫基因以及与新功能相关的基因(簇)进行了分析。结果如下,a,在Bt中一共发现了93类不同的杀虫基因,大部分的Bt菌株(76%,N=150)均携带1-12类不等的杀虫基因。并且在14株B.cereus菌株中也发现有携带杀虫基因的现象,这可能是由于污染或质粒交换等原因造成的;b,Bt和B.cereus中均存在肠毒素、溶血素、几丁质酶、胶原酶蛋白、羊毛硫细菌素、免疫抑制因子类等与杀线虫相关的功能基因(簇),Bt中还存在有杀线虫活性的杀虫蛋白基因,并且Bt(53.07%,N=5,851)携带数量多于B.cereus(46.93%,N=5,851)菌株;c,只有Bt菌株4BR1含有一类特有的具有杀螨活性的cry3A类毒素基因;d,Bt和B.cereus中都存在丰原素、表面活性素、伊枯草菌素以及杀镰孢菌素类等与抗真菌相关的功能基因(簇),Bt(55.41%,N=1,285)携带数量多于B.cereus(44.59%,N=1,285)菌株;e,Bt和B.cereus中都存在细菌素以及AiiA降解酶类等与抗细菌相关的功能基因(簇),Bt(54.75%,N=1,989)携带数量多于B.cereus(45.25%,N=1,989);f,Bt和B.cereus中都存在铁载体、磷酸、多糖、乳酸、脯氨酸、生长素、柠檬酸、琥珀酸、氮代谢信号传导蛋白、2,3-丁二醇、铵转运载体蛋白、ACC脱氨酶、草酸、氨甲酰转移酶类等与促植物生长相关的功能基因(簇),另外少数Bt菌株中还存在生长素输出载体类基因,某些B.cereus中存在特有的植酸酶基因,总体来说Bt(49.80%,N=16,255)携带数量要少于B.cereus(50.20%,N=16,255);g,Bt和B.cereus中均存在硝酸还原酶类等与合成金属纳米粒子相关的基因(簇),且Bt(50.97%,N=1,336)携带数量多于B.cereus(49.03%,N=1,336);h,Bt菌株Sbt003以及T13001中携带有抑制癌细胞活性的cry65Aa类毒素基因。另外我们通过antiSMASH 3.0数据库预测到这些可变基因家族中共存在167个潜在的次生代谢产物生物合成基因簇家族,分为15类(括号里的数字代表对应的数量),分别为arylpolyene(3),bacteriocin(6),furan(1),ladderane(3),lanthipeptide(37),NRPS(89),NRPS,T1PKS(2),NRPS-like(11),other(1),PKS-like(1),sactipeptide(3),siderophore(3),T1PKS(4),T3PKS(1),terpene(2)。同时KEGG以及COG功能注释结果显示有很大一部分基因目前还没有明确或已知的功能,以上这些基因可能隐藏了与Bt菌株功能多样性相关的重要信息。此外,对150株Bt菌株的功能进化特征分析结果表明,大部分的功能基因(簇)分布在CladeⅡ(71.93%,N=14,158)中,小部分分布在CladeⅠ(21.83%,N=14,158)中,剩余功能基因(簇)分布在CladeⅢ(5.02%,N=14,158)以及CladeⅣ(1.21%,N=14,158)中。CladeⅠ、CladeⅡ以及CladeⅢ菌株分别携带77-102、75-109以及85-100类相关功能基因(簇),CladeⅣ中的两株Bt菌株均携带86类相关功能基因(簇)。上述结果表明Bt具有大量待发掘的潜在功能基因(簇),因此进一步发掘Bt新功能并探索推进其在新领域的应用,对促进Bt资源高效利用将有重要意义。(3)Bt鞘翅目杀虫活性进化特征分析。近年来,鞘翅目为害呈上升趋势。我们通过对相关文献及专利数据的查询,对鞘翅目杀虫蛋白基因进行了统计分析,并结合菌株进化分析结果,对Bt鞘翅目杀虫活性进化特征进行了研究。当前为害较为严重的鞘翅目害虫主要来自叶甲总科和金龟科。a,对金龟子类害虫有活性的Bt杀虫蛋白主要有Cry3、Cry7、Cry8、Cry23/37和Vip1/Vip2类,以及来自B.popilliae(A型)的Cry18和来自Paenibacillus lentimorbus(B型)的Cry43;b,对叶甲总科害虫有活性的Bt杀虫蛋白主要有Cry1、Cry3、Cry34、Cry34/Cry35、Cry55、Cry6、Cry7、Cry8、Cyt2、Sip、Vip1/Vip2、Vip2类,以及对玉米害虫玉米根叶甲具有不错活性的来自Pseudomonas chlororaphis的IPD072Aa蛋白,来自Alcaligenes faecalis的AfIP-1A/1B蛋白,以及来自P.mosselii的PIP-47Aa蛋白。这也给今后鞘翅目害虫的防治提供了新的视角与思路。此外,150株Bt菌株的鞘翅目杀虫活性进化特征分析结果表明,共有45个杀虫蛋白基因与鞘翅目防治相关,其中大部分分布在CladeⅡ(75.56%,N=45)中,剩余有11个分布在CladeⅠ(24.44%,N=45)中。并且CladeⅡ中有鞘翅目杀虫活性的基因集中分布在CVTⅡ13(29.41%,N=34)、CVTⅡ3(26.47%,N=34)以及CVTⅡ7-8(17.65%,N=34)类菌株中。(4)金龟子昆虫的基因组研究。金龟子类害虫对杀虫蛋白的耐受性最强。为了探索其耐受机制并提高该类害虫的防治效果,我们对两种金龟子类害虫白星花金龟和大黑鳃金龟进行了基因组研究。首先k-mer分析表明这两种昆虫预估的基因组大小分别为810 Mb以及1.34Gb,杂合度分别为2.35%以及2.17%,表明该两种昆虫基因组杂合度较高,均属于复杂基因组。为了解决杂合度高引起的组装难题,进一步我们设计了分层组装流程,将杂合的等位序列分开进行组装,保证了组装质量。基于该方法,我们完成了白星花金龟的基因组组装与注释,解决了当前白星花金龟研究中基因资源匮乏的窘境,为今后该昆虫的遗传研究与防治提供了宝贵的数据资源。综上,本研究基于组分矢量法CVT建立了一种能够有效反映遗传特征的新菌株分型系统,对Bt菌株进行进化分析。进一步,利用功能基因注释的策略对Bt潜在功能、鞘翅目害虫杀虫活性进行分析,并结合菌株进化分析结果,研究了Bt菌株功能进化的特点,相关结果表明菌株遗传特征与功能活性之间具有一定的关联性,为今后推进Bt菌株资源的研究与利用提供基础。新菌株分型系统CVT能够有效地分析菌株多样性,从而有助于进一步去除菌株资源库中的冗余菌株并筛选可用于基因发掘的新菌株,提高基因发掘包括杀虫基因以及潜在功能基因的效率。此外,为了提高鞘翅目金龟子类害虫的防治效果,对其中的白星花金龟进行了基因组测序与研究,为进一步从遗传的角度分析该类害虫耐受Bt感染的机制奠定了基础。
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in 等人对如何使用基因组数据来全面描述菌株特菌株的基因组数据，可有些物种仍然会发现新的种即使再测数百个基因组也依旧会有新的基因被株基因组特征的概念，“泛基因组 （pan-genome）部基因，由核心基因（core gene）、非必需基因（-specific gene）这三部分组成（图 1-1）[1]。其中仅在某些菌株（至少两株）中存在，而菌株特有基因代表某物种中所有能够编码该物种基本生物需基因和特有基因等可变基因代表该物种的多样及对细菌生长并不是必需的但能够有利于细菌生基因[2]。对非必需基因的研究和功能注释发现假多数归属于此类基因，虽然在一个典型的基因组必需基因对物种的生存和维持并不是必需的，病原菌中，这类基因的减少通常会伴随着菌株相菌的体外连续培养中发现，编码菌毛的基因会发结构在菌株的定殖中会起到重要的作用。与此相纤毛状的结构，这种结构并不是在所有菌株中都关基因的出现或丢失[4]。

图 1-2 无乳链球菌和炭疽芽胞杆菌的泛基因组特征图[2]ig. 1-2 Pan-genome analysis of Streptococcus agalactiae and Bacillus anthra基因组分析软件GAP因组自动化分析软件（Pangenome Analysis Pipeline，PGAP）[6]是赵永兵等 Perl 语言、应用于分析原核生物泛基因组学的自动化分析流程[7]。该流程块组成，分别是对功能基因的聚类分析、对功能基因遗传变异的分析、对富集分析、系统发育分析以及泛基因组的特征分析（图 1-3）[7]。
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S476
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本文编号：2684575