柑橘黄龙病快速检测技术研制及应用

发布时间：2020-05-31 09:29

【摘要】：柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing,HLB)是世界柑橘生产上极具毁灭性的病害。我国至今尚无有效的药剂可用于根治黄龙病,也未见报道选育出可靠的抗病品种和砧木,主要以挖除病树、防控柑橘木虱、使用无病苗木的手段来防控黄龙病。因此,柑橘苗木带病情况及大田植株感病情况的快速检测对有效防控柑橘黄龙病尤为重要。柑橘黄龙病的检测方法主要有常规PCR、巢式PCR、定量PCR、显微镜观察、血清学诊断、光谱检测等。由于柑橘黄龙病菌具有多样性,前人报道的柑橘黄龙病病原菌抗体多数均只能与相似的抗原结合,不能广泛地应用于不同区域、不同品种的柑橘黄龙病检测。环介导等温扩增(LAMP)技术相比于传统的检测方法,更省时省力,节约检测成本。因此,本论文针对广西柑橘黄龙病病原开展了多克隆抗体的研究,同时建立柑橘黄龙病可视化LAMP体系并对广西部分地区的柑橘苗木和田间植株进行黄龙病检测。主要研究结果如下:(1)根据NCBI数据库中多条柑橘黄龙病病原菌外膜蛋白omp基因,设计特异引物克隆目的片段并构建原核表达载体pET32a-omp1,将其质粒转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中进行重组蛋白诱导表达。在优化后的条件下(添加诱导剂IPTG0.6 mM,在37℃下诱导表达5 h)诱导得到大量以包涵体形式表达的重组蛋白。经Western Blot验证,成功获得约55kDa的重组蛋白。将该重组蛋白进行纯化(纯度≥90%)后作为抗原,制备柑橘黄龙病病菌omp多克隆抗体,最终得到效价超过1:512 K的多克隆抗体(2)利用PrimerExplorer V5在线软件在柑橘黄龙病病原菌16SrDNA序列保守区域的6个位点设计LAMP引物,对LAMP反应体系与反应条件进行优化得到Mg2+6 mM,dNTP 1.2 mM,FIP/BIP 1.6 μM,F3/B3 0.2 μM,B.st DNA聚合酶大片段0.24 U/μL,1O×ThermoPol 2.5μL,0.2%Tween-20为最佳反应体系,65℃反应50 min,80℃灭活7 min为最优反应条件,添加1μL10倍稀释的SYBR Green I核酸染料显色观察反应结果。建立的LAMP体系仅对黄龙病基因进行扩增,特异性高。将感染柑橘黄龙病植株叶脉总DNA倍比稀释后作为模板检测灵敏度,LAMP检测下限可达2.18ng/μL,高于常规PCR检测100倍,与荧光定量PCR相当。应用常规PCR和建立的可视化LAMP检测方法对广西部分地区的不同品种柑橘苗木和田间植株进行黄龙病检测。网室培育的25株香橙砧木和25株香橙砧金秋砂糖桔嫁接苗,均未检测出柑橘黄龙病菌;田间植株155株,柑橘黄龙病LAMP检测方法检出的阳性率为13.6%,常规PCR检测方法的阳性率为11.6%,常规PCR检测结果为阳性的样品在LAMP检测结果中均为阳性,建立的LAMP体系可用于广西柑橘黄龙病田间样品与苗木的快速检测。
【图文】：

柑橘黄,黄化

Ａ：正常叶；Ｂ：缺锌状黄化；Ｃ：叶脉黄化；Ｄ：均勾黄化；Ｅ：斑驳黄化；Ｆ：枝梢黄化；Ｇ：红鼻逡逑子果；Ｈ：整株树黄化逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｓｙｍｐｔｏｍｓ邋ｏｆ邋Ｃｉｔｒｕｓ邋Ｈｕａｎｇｌｏｎｇｂｉｎｇ逡逑Ａ：邋Ｎｏｒｍａｌ邋ｌｅａｆ；邋Ｂ：邋Ｚｉｎｃ邋ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ邋ｙｅｌｌｏｗｉｎｇ；邋Ｃ：邋Ｌｅａｆ邋ｖｅｉｎ邋ｙｅｌｌｏｗｉｎｇ；邋Ｄ：邋Ｕｎｉｆｏｒｍ逡逑ｙｅｌｌｏｗｉｎｇ；邋Ｅ：邋Ｍｏｔｔｌｅｄ邋ｙｅｌｌｏｗｉｎｇ；邋Ｆ：邋Ｓｈｏｏｔ邋ｙｅｌｌｏｗｉｎｇ；邋Ｇ：邋Ｒｅｄ邋ｎｏｓｅ邋ｆｒｕｉｔ；邋Ｈ：邋Ｔｈｅ邋ｗｈｏｌｅ逡逑ｔｒｅｅ邋ｙｅｌｌｏｗｉｎｇ逡逑１．１．３柑橘黄龙病的传播途径逡逑柑橘黄龙病短距离传播主要是通过采用感病的接穗或砧木进行嫁接以及柑Ｋｕｗａｙａｍａ）吸食感病植株的汁液后再去取食健康植株的汁播，柑橘木虱是目前报道黄龙病的唯一传播虫媒。此外，黄龙病还可以通过菟丝植株间传播（柯穗等，１９８６）。长距离的传播是通过将染病的苗木远距离运输域，再通过上述３种途径进行大范围的扩散。目前尚未见有柑橘黄龙病可通过的报道，也不会通过汁液摩擦和土壤传播。逡逑

示意图,引物设计,示意图

等于２０００年开发的一种高效、简便、廉价的核酸恒温扩增方法。该技术针对靶基因的６逡逑个特定区域（Ｆ３、Ｆ２、ＦＩ、Ｂ３、Ｂ２、Ｂ１）设计４条特异引物，包括两条外引物（Ｆ３／Ｂ３）逡逑和两条内引物（ＦＩＢ／ＢＩＰ）（如图１－２），借助具有链置换作用的Ｂｓｔ邋ＤＮＡ聚合酶在恒逡逑温条件下进行靶序列高效扩增。在ＬＡＭＰ反应的过程中析出大量的焦磷酸根离子与反应逡逑体系中的Ｍｇ２＋结合，，形成焦磷酸镁沉淀，因此，反应结束后可通过肉眼观察把序列是逡逑否存在，或者借助浊度计检测。也可以通过添加荧光显色剂来观察反应结果，常用的荧逡逑光染料有钙黄绿素（Ｃａｌｃｅｉｎ）、羟基萘酚蓝（ＨＮＢ）、Ｄｙｅ６３、ＳＹＢＲ邋Ｇｒｅｅｎ邋Ｉ。ＬＡＭＰ逡逑的反应产物是一系列大小不一的ＤＮＡ片段混合物，因此也可以通过琼脂糖凝胶电泳检逡逑测有无梯状条带来判定检测结果。逡逑ＥＥ１逡逑ｆ＞ｒｉ，，ｌｆｒ＼邋Ｆ３Ｃ邋Ｆ２ｃ邋Ｆｉｒ邋Ｔａｒ？ｅＣ邋ＤＮＡ逦Ｒ１邋Ｂ２邋Ｂ３逡逑ｆｖ＝Ｓｓ邋逦Ｓ＝Ｋ邋＝１逡逑Ｆ３邋Ｆ２邋ＦＩ逦Ｂｉｔ邋Ｂ２ｃ邋Ｂ３ｃ邋逦逡逑Ｓ＇邋ｎｍｓ＇邋３３逡逑Ｂ３邋Ｐｒｉｍｅｒ逡逑图１－２邋ＬＡＭＰ引物设计示意图逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｄｅｓｉｇｎ邋ｏｆＬＡＭＰｐｒｉｍｅｒｓ逡逑（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｅｎｋｕ．ｂａｉｄｕ．ｃｏｍ／ｖｉｅｗ／０９４ｄｆ３５ａａｄ５邋ｌｆＤ邋ｌｄｃ２８１邋ｆｌ邋ａａ．ｈｔｍｌ）逡逑ＬＡＭＰ技术的基本原理是：当反应开始时，由于上游内引物ＨＰ的Ｔｍ值和浓度均逡逑大于上游外引物Ｆ３
【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S436.66

【参考文献】