PdtWRKY86在杂交杨锈菌互作中的功能

发布时间：2020-06-03 23:27

【摘要】：杨树是世界上适应性最强、分布最广的树种。随着杨树人工林面积的不断扩大,我国现拥有世界上面积最大的杨树人工林。杨树是一个易发生病虫害的树种,其中危害杨树的致病菌株有300多种,我国报道存在的有110多种。在杨树叶部病害中,落叶松-杨栅锈菌(Melampsora larici-populina)引起的杨树叶锈病分布最广、危害最大。通过落叶松杨栅锈菌E4强致病株系接种后两个杨树品种的症状及其间苯三酚染色判定杂交杨与E4锈菌互作为非亲和型互作,欧美杂交杨与E4锈菌互作为亲和型互作。以杂交杨为主要研究对象,欧美杂交杨作对照,对E4锈菌侵染后96 h两个品种转录组数据进行分析发现,转录因子参与杂交杨应答E4锈菌侵染,其中NAC、WRKY、MYB、AP2和ERF所占比例较大。进一步对转录组数据中重要的5个转录因子家族进行分析发现,大部分WRKY转录因子在杂交杨应答E4锈菌12 h和96 h上调表达,起正向调控作用。WRKY转录因子家族属于调控蛋白家族,是植物防御信号转导中至关重要的因子。以杂交杨转录组数据为基础,鉴定到100个PdtWRKY基因,其中99个PdtWRKY基因分别对应在毛果杨19条染色体上,PdtWRKY100定位于Scaffold_41。转录组数据分析表明杂交杨接种E4锈菌后有53个基因差异表达(8个基因下调,45个基因上调),选择上调表达的基因进行进一步研究。对45个基因进行靶基因预测,其中有28个基因找到相应的靶基因,共有305个靶基因,建立调控网络。对靶基因进行分类整理后,发现其中有21个靶基因具有转录因子活性,其中包括PdtWRKY64,它的上游基因为PdtWRKY86。PdtWRKY86在杂交杨接种E4锈菌后上调表达,转录调控唯一的靶基因PdtWRKY64,PdtWRKY64又转录调控18个基因,其中12个与植物抗病相关。由此表明PdtWRKY86具有多级调控网络,它的靶基因在杂交杨接种E4锈菌后也上调表达,因此筛选出PdtWRKY86基因作为研究对象。为明确PdtWRKY86基因在杂交杨与E4锈菌互作过程中的功能,克隆该基因、对7个时间点表达量进行分析并进行转基因验证。PdtWRKY86CDS全长为965 bp,编码311个氨基酸。除6 h外其余6个时间点均上调表达,表明PdtWRKY86在杂交杨与E4锈菌非亲和互作过程中起到正向调控作用。PdtWRKY86转基因拟南芥阳性植株较野生型拟南芥接种灰葡萄孢和致病疫霉后发病慢、病斑小,PdtWRKY86转基因拟南芥较野生型拟南芥抗病性强,表明PdtWRKY86转基因植物通过多级调控抗病相关基因的表达,提高转基因植物的抗病性。综上所述,证明PdtWRKY86是杂交杨-E4锈菌非亲和型互作过程的正向调控因子。
【图文】：

锈菌,杨树叶,症状,叶片

Ｅ４锈菌接种欧美杂交杨叶片后２邋ｈ锈菌孢子萌发，到２４邋ｈ叶片未发生明显症状，逡逑４８邋ｈ叶片出现褪绿小斑点，％邋ｈ叶背出现明显的黄色斑点并逐渐扩大，至１６８邋ｈ叶背形逡逑成多个夏孢子堆（图２－１），此时Ｅ４锈菌完成夏孢子的生活史，判定欧美杂交杨为Ｅ４逡逑锈菌的亲和型品种。Ｅ４锈菌接种杂交杨叶片后２邋ｈ锈菌孢子也萌发，至４８邋ｈ叶片均未逡逑观察到明显症状，９６邋ｈ叶背出现褪绿点斑并逐渐扩大，颜色变深，至１６８邋ｈ时叶背组织逡逑出现多处坏死斑点并产生少数夏孢子堆（图２－１），判定杂交杨为Ｅ４锈菌的非亲和型品逡逑种。逡逑ＣＫ邋２ｈ邋６ｈ邋１２邋ｈ邋２４邋ｈ邋４８邋ｈ邋９６邋ｈ邋１６８邋ｈ逡逑■■■■■■逡逑图２－１邋Ｅ４锈菌接种杨树叶片症状逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－１邋Ｉｎｆｅｓｔａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｐｏｐｌａｒ邋ｌｅａｖｅｓ邋ｗｉｔｈ邋Ｅ４邋ｒｕｓｔ逡逑接种后的叶片经过间苯三酚染色，叶片被染红部分则为木质素的积累。在欧美杂交逡逑杨接种叶片上发现，在２邋ｈ到２４邋ｈ叶片透明部分没有明显症状，叶脉呈红色，４８邋ｈ叶片逡逑透明部分有深色斑点，逐渐扩大，９６邋ｈ叶片透明部分斑点增大，至１６８邋ｈ透明部分可以逡逑看到多个夏孢子堆，夏孢子堆呈棕色（图２－２）。根据Ｃｅ＇ｃｉｌｅ邋Ｒｉｎａｌｄｉ等人研究表明木质逡逑素在非亲和型互作过程中锈菌侵染部位沉积较多１９１。欧美杂交杨叶片１６８邋ｈ木质素积累逡逑较少

锈菌,基因,杂交杨,叶片

逑９６邋ｈ叶片透明部分有暗棕色小斑点，斑点逐渐扩大，至１６８邋ｈ时叶片透明部分可以看到逡逑大块黄色坏死斑点和少数夏孢子堆（图２－２）。杂交杨叶片１６８邋ｈ木质素积累较多，叶片逡逑整个染为红色，进一步判定杂交杨与Ｅ４锈菌互作为非亲和型互作（ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ逡逑ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ邋）0逡逑ＣＫ逦２ｈ逦６邋ｈ逦１２邋ｈ邋２４邋ｈ邋４８邋ｈ邋９６邋ｈ邋１６８邋ｈ逡逑－邋；邋ｒ邋；邋ｖ邋＼：ｒ逡逑一逡逑图２－２间苯三酚染色逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－２邋Ｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ逡逑２．２．２接种Ｅ４锈菌后表达差异的杨树基因及ＧＯ富集分析逡逑经过对９６邋ｈ两个杨树品种的ＣＫ组和接种组转录组数据分析，在接种Ｅ４锈菌后其逡逑表达量ｌｏｇ２（ｒｕｓｔ＋／ＣＫ）有差异，，并且差异极显著（综合数据中用ｘ２邋（／＾０．０１）确定）的杨逡逑树基因共有１，２２８个。逡逑ＧＯ富集分析对１，邋２２８个基因进行注释。与所有的差异表达的杨树基因相比，其中逡逑２８１个基因显著富集与ＤＮＡ依赖转录调控有关（ＧＯ：邋０００６３５５，邋ｐ邋＝邋１．０ｅ－０７，邋ＦＤＲ邋＝逡逑１．６０ｅ－０５）。进一步富集２８１个基因后，与转录因子活性相关的１３８个基因（ＧＯ：逡逑０００３７００
【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S763.7

【参考文献】