水稻黑条矮缩病毒蛋白P9-1调控病毒在灰飞虱中增殖扩散的机理研究

发布时间：2020-06-04 08:12

【摘要】：水稻病毒病是对水稻生产危害最严重的病害之一,严重影响了水稻的产量和品质。其中,水稻黑条矮缩病毒(Rice black streaked dwarf virus,RBSDV)和水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)是对水稻危害最为严重的两种病毒,两者均通过灰飞虱(Laodelphax striatellus)传播。植物病毒与介体昆虫之间相互作用的研究是分析介体传毒机制,控制病毒传播的主要手段。RBSDV的非结构蛋白P9-1在病毒侵染过程中形成病毒原质结构(毒质,viroplasm),可能对病毒的复制和侵染具有非常重要的作用。本研究以灰飞虱和水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)为实验材料,以RBSDV的P9-1为诱饵蛋白筛选灰飞虱的cD NA文库,并对筛选到的可能参与介体传毒的26S蛋白蛋白酶体亚基Rpn8进行功能验证,对Rpn8发挥作用的分子机理进行初步分析。主要结果及结论如下:(1)P9-1定位于细胞质。通过亚细胞定位分析发现P9-1定位于细胞质,且呈毒质形式存在。(2)RBSDV的病毒蛋白P9-1与灰飞虱26S蛋白酶体亚基Rpn8互作。病毒与介体昆虫蛋白的互作研究是了解介体传毒机制的主要方法,因此,我们以P9-1为诱饵蛋白钓取灰飞虱的cD NA文库,并获得了包括Rpn8在内的11个可能与P9-1互作的蛋白。有研究表明,26S蛋白酶体参与调控病毒在介体灰飞虱中的传播,而Rpn8是26S蛋白酶体的一个亚基,所以,我们以Rpn8为主要研究对象,并通过免疫共沉淀(Co-IP)以及双分子荧光互补(BiFC)实验证明了Rpn8确实与P9-1互作。(3)Rpn8负调控灰飞虱中RBSDV的积累。为检测Rpn8是否参与调控病毒传播,体外合成ds Rpn8并饲喂带毒灰飞虱以下调Rpn8的表达。发现灰飞虱体内RBSDV的外壳蛋白编码基因CP的表达水平升高,说明灰飞虱体内的病毒积累量增加。将Rpn8 RNAi转基因水稻接种带RBSDV的灰飞虱,发现转基因水稻的感病率高于野生型。表明Rpn8下调表达有利于灰飞虱中RBSDV的积累与传播。(4)RBSDV抑制灰飞虱26S蛋白酶体功能。qRT-PCR实验结果表明带RBSDV的灰飞虱中Rpn8的表达量显著低于无毒灰飞虱;Western blot实验结果显示带毒灰飞虱中泛素化蛋白积累量高于无毒灰飞虱,说明RBSDV可能通过降低Rpn8的表达从而影响灰飞虱26S蛋白酶体的功能。(5)灰飞虱26S蛋白酶体亚基Rpn8与Rpn7互作。酵母双杂交(Y2H)实验、荧光素酶互补实验(LCI)以及体外免疫共沉淀(pull-down)实验表明Rpn8与灰飞虱中26S蛋白酶体另一个亚基Rpn7互作,且P9-1与Rpn7不互作。(6)Rpn8亦与RSV的P2蛋白互作。qRT-PCR结果显示,带RSV的灰飞虱中Rpn8的表达量亦低于无毒灰飞虱,说明RSV可能通过降低Rpn8的表达调控26S蛋白酶体功能。Rpn8的下调促进灰飞虱中RSV的积累并且Rpn8 RNAi转基因水稻对RSV的感病率增加,说明Rpn8负调控灰飞虱中RSV的积累与传播。之后我们通过Y2H实验发现Rpn8与RSV的P2蛋白互作,LCI和Co-IP实验进一步证明两者互作。以上结果表明RSV通过干扰灰飞虱26S蛋白酶体功能促进病毒积累的作用机制与RBSDV相类似。综上所述,RBSDV可能通过降低Rpn8的表达从而调控灰飞虱26S蛋白酶体功能,促进病毒在灰飞虱中的积累。已知26S蛋白酶体各组分间的互作决定其功能发挥,而本研究证明灰飞虱中Rpn8与Rpn7互作、病毒蛋白P9-1与Rpn8互作,而P9-1与Rpn7不互作。因此我们推测RBSDV还可能通过P9-1影响Rpn8与Rpn7的互作抑制灰飞虱26S蛋白酶体功能,从而促进其在灰飞虱体内的积累,具体机制有待进一步研究。
【图文】：

系统概述,蛋白酶体,泛素

物质进入水解腔是由 α 环控制的，它只允许未折叠的；19S 调节粒子（RP）可以进一步分解成两个亚复合物，（Base），另一个是外部的盖子复合物（Lid）（Glickman ase（ATPases 与多种细胞活性相关）亚基：Rpt1-Rpt6 和 4n2、Rpn10 和 Rpn13 组成。基底中的 ATPases 是底物蛋白S 水解腔中所必须的（Braun et al., 1999；Rubin et al., 1998ase 亚基组成：Rpn3、Rpn5-Rpn9、Rpn11、Rpn12 和 Sem对底物的去泛素化（Verma et al., 2002；Yao and Cohen, 20004）。Rpn10 是能和其他蛋白酶体可逆结合的泛素受体蛋白化的蛋白传递到蛋白酶体中（Elsasser and Finley, 2005）。蛋白水解作用并且介导泛素标签的识别和回收利用以及去 CP 中进行水解（Ravid and Hochstrasser, 2008；Finley, 200

本生,烟叶,荧光强度,表达水平

果与分析P9-1 是 RBSDV 的弱沉默抑制子有研究表明，P9-1 在 RBSDV 侵入动植物细胞后形成毒质的过程中发挥重要 P9-1 可能是 RBSDV 的弱沉默抑制子（Zhang et al., 2008）。因此，我们构建了9-1 融合表达载体 35S::P9-1-GFP，以强沉默抑制子 P19 与 GFP 的融合表达:P19-GFP 作为阳性对照，瞬时表达载体 35S::GFP 为阴性对照。利用农杆菌介染本生烟，3d 后在紫外灯下观察 GFP 荧光强度，发现超表达 P9-1 后，GFP 的低于超表达 P19 后的荧光强度但明显高于阴性对照（图 3-1A）。将上述本生烟取材，分别提取总 RNA 和 sRNA，利用 Northern blot 分别检测三组样品中 GA 和 siRNA 的积累量，结果显示瞬时超表达 P9-1 后 GFP siRNA 的积累量明白对照但高于阳性对照（图 3-1B），，说明 P9-1 能够抑制 siRNA 积累，降低沉
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S435.111.4

【参考文献】