烟草野火病菌与角斑病菌LAMP快速检测方法的建立与应用

发布时间：2020-06-04 10:37

【摘要】：烟草野火病和烟草角斑病是烟草生产过程中两种主要的细菌性病害,侵染烟草后会造成烟草叶片穿孔,变褐,烤后叶片易碎,工业使用性降低,对于烟农的增产增收造成严重的影响。因此,建立一套烟草野火病和角斑病的精准可视化检测体系,能够在烟草叶片中未显症之前进行检测和预警,可为病害的防治提供依据,具有重要的理论和现实意义。环介导等温扩增技术(Loop-mediated Isothermal Amplification,简称LAMP),具有检测速度快、对检测环境要求低、特异性高、灵敏性强等优点,目前被广泛应用于医学,动植物病害检测,转基因食品检测等领域。本试验将LAMP技术用于烟草野火病和烟草角斑病的检测,利用全基因组比对的手段,分别获得了1组烟草野火病菌和角斑病菌的LAMP特异性检测引物,在此基础上,建立和优化了两种病原的LAMP快速检测方法,并进行了田间应用,为病害发生预报提供了一种新的技术和手段。主要研究结果如下:(1)分离与纯化了烟草野火病菌和烟草角斑病菌。分别对来自于不同地区的烟草病叶标本进行了病菌的分离、纯化和鉴定,最终获得纯化的烟草野火病菌与烟草角斑病菌。(2)对烟草野火病菌进行普通PCR引物设计,最终得到烟草野火病的特异性引物40429,并验证其特异性。试验利用mavue2.3.1软件进行全基因组的比对,根据筛选出来的特异性区段,利用Primer Premier 6.0软件设计引物。将设计的引物与对照菌株进行普通PCR扩增对照,最终获得了一组特异性引物。(3)试验分别获得了一组烟草野火病菌和一组烟草角斑病菌的LAMP引物。根据普通PCR特异性引物对应的特异性区段,利用LAMP在线设计网站LAMP primer designing software PrimerExplorer V5,设计了烟草野火病菌LAMP检测引物并进行了验证;由于缺少烟草角斑病菌的全基因组数据,试验通过利用烟草野火病菌的普通PCR引物对于烟草角斑病菌进行扩增,同时对于扩增产物测序,并与烟草野火病菌的扩增产物测序结果相比对,最终获得了烟草野火病与烟草角斑病存在的差异片段。基于此,设计了烟草角斑病菌的特异性引物378/379/380/381,并验证了引物的特异性。(4)建立并优化了烟草野火病与烟草角斑病LMAP快速检测体系。基于LAMP检测体系中参与反应的反应物,对BST DNA Polymerase的使用量,dNTP的使用量,Mg~(2+)的使用浓度,甜菜碱的使用浓度,内外引物的配比,反应时长,反应温度等反应条件进行优化,最终确定了最优化的田间LAMP检测工作浓度。(5)将建立的烟草野火病与烟草角斑病LAMP检测体系与田间应用相结合,验证了检测体系的可靠性。利用田间采样的疑似染病叶片及健康叶片作为对照,通过和普通PCR、荧光定量PCR做对比,试验最终确定了LAMP检测体系的可靠性以及灵敏性。
【图文】：

1 2 3 4 M 5 6 7 8析斑病菌的分离与鉴定培养平板上取混合菌液进行 PCR 扩增，如图 1 所示，以烟草野火，其能够在引物 421/422 的作用下产生大小为 423 bp 大小的目的 的作用下产生大小为 1263 bp 大小的目的条带；而含有烟草角斑6-8）在引物 421/422 的作用下产生 423 bp 大小的目的条带，但下未产生 1263 bp 大小的条带。说明混合菌液中含有烟草角斑病菌。

图 2 烟草角斑病单斑 PCR 产物电泳图Fig.2 Electrophoresis of PCR product of P. syringae pv. angulata single spot为烟草野火病菌；2/8,3/9,4/10,5/11,6/12 模板为疑似烟草角斑病菌单斑；1-6 使用引物为引物 421/4使用引物为引物 423/424；M 为 DL2000 marker,7 template is P. syringae pv. tabaci. 2/8,3/9,4/10,5/11,6/12 template is suspected single spot of P. syringaeangulata. 1-6 using primer is 421/422. 7-12 using primer is 423/424. M is DL2000 marker.草角斑病菌的接种验证化后培养的烟草角斑病菌接种到烟草叶片后，7 天后观察发病情况，如图后，，烟草叶片已经发病，叶片有不规则的角状病斑，根据烟草角斑病的田确定病斑为烟草角斑病病斑，证明纯化的病菌即为烟草角斑病菌。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S435.72

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本文编号：2696256