灰飞虱糖转运蛋白6在水稻条纹病毒侵染中肠上皮细胞中的作用

发布时间：2020-06-05 01:18

【摘要】：水稻条纹叶枯病是亚热带地区危害最严重的水稻病害之一。水稻条纹叶枯病是由属于纤细病毒属(Tenuivirus)的水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)侵染水稻引起的。RSV主要是由灰飞虱(Small brown planthopper,SBPH)以持久增殖的方式传播。研究表明RSV编码的核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein,NP)在病毒传播方面起着十分重要的作用,因此筛选并研究与RSV NP互作的介体蛋白质对于揭示灰飞虱传播RSV的机制是必不可少的。本论文选择了一个可能在RSV侵染灰飞虱中肠上皮细胞时发挥重要作用的蛋白质即糖转运蛋白6(sugar transporter of Laodelphax striatellus,LsST6)进行研究。通过跨膜区在线预测软件分析发现其含有12个跨膜区,并且在TM2和TM3之间存在一个保守的GRK结构域,因此推测LsST6属于主要促糖转运蛋白超家族。酵母双杂交实验再次验证RSV能够与LsST6互作,免疫共沉淀实验也证实了RSV NP与LsST6存在互作关系。利用草地贪夜蛾细胞系进行亚细胞定位发现,LsST6主要定位在细胞膜上,而RSV NP定位在细胞质中。当在Sf9 Cell中共表达时,RSV NP却定位于细胞膜上,并且与LsST6共定位。这表明LsST6能够改变这RSV NP在细胞中的定位。RT-qPCR发现LsST6在灰飞虱的肠道中大量表达。利用制备的LsST6单克隆抗体进行肠道定位发现,LsST6定位在中肠上皮细胞的细胞膜及细胞质中。将无毒灰飞虱饲毒处理后经免疫荧光标记发现RSV在第二天开始侵染灰飞虱肠道并且能够与LsST6共定位于上皮细胞的细胞膜上;第四天和第八天时两者仍有共定位在上皮细胞膜上的情况。因此推测LsST6可能在RSV侵染中肠上皮细胞中发挥重要作用。为进一步确定LsST6的功能,将提纯的RSV病毒粒子加入到培养的Sf9细胞中。结果发现当该细胞系表达外源的LsST6时,RSV病毒粒子可以进入到该细胞中,而不能进入未表达LsST6的细胞中。Northern-blot结果显示随着RSV病毒粒子加入Sf9细胞时间的延长,RSV在RNA水平上的量是持续增加的。RT-qPCR结果同样显示在RSV病毒粒子加入到Sf9细胞后,随着时间的增加RSV在RNA水平的含量不断增加。这些实验结果表明LsST6是RSV能够成功侵染Sf9细胞的一个重要因子。通过显微注射dsRNA确定是否能够有效干扰LsST6在无毒灰飞虱体内的表达,结果发现注射dsLsST6的灰飞虱与注射dsGFP的对照组相比,LsST6在RNA水平上的表达显著降低并且抑制效果可以持续12天以上。进一步实验发现注射dsLsST6后无毒灰飞虱获取以及传播RSV的能力显著的降低,但是带毒灰飞虱体内RSV含量以及传毒率却没有明显的变化。以上结果充分表明LsST6作为一个关键因子参与了RSV侵染灰飞虱中肠上皮细胞的过程,但是不会影响RSV在细胞内的复制。
【图文】：

1图 1.1 RSV 在水稻上的症状及危害（A：RSV 侵染症状；B：RSD 田间发生状况）g. 1.1 Symptom and damage of RSV in rice (A: Symptom of RSV infection in rice leaf, B: Occurrence of RSD infield)着近年来对水稻条纹叶枯病进行有针对性的预测预报，防控昆虫传毒介体数量以及抗病新选育以及推广，，水稻条纹叶枯病在全国的发生面积以及危害程度都有显著的下降。但是研

图 1.2 RSV 的基因组结构图Fig. 1.2 Genome structure of RSV表 1.1 RSV 的基因组及编码蛋白的功能Table.1.1Genome and protein functions of RSV的传播介体及循回路径
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S435.111.4

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本文编号：2697268