杨生褐盘二孢菌专化寄生特性及效应分子研究

发布时间：2020-06-05 05:37

【摘要】：杨树黑斑病是杨树的主要病害之一。在我国,其最主要的病原菌为杨生褐盘二孢菌(Marssonina brunnea),该菌能够侵染青杨派、黑杨派、白杨派的很多种类和品种,对杨树人工林的危害尤为严重。杨生褐盘二孢菌有两个专化型,即单芽管专化型(M.brunnea f.sp.monogermtubi)和多芽管专化型(M brunnea f.sp.multigermtubi)。在自然条件下,它们分别侵染不同派系的杨树寄主,非亲和派系杨树对专化型具有稳定的抗病性,因此成为杨树抗病育种研究的重要体系。然而,目前有关两个专化型的详细侵染过程和寄生特性等尚不明确,这直接阻碍了研究工作的深入开展。同时,效应分子作为病原菌的关键致病因子,是抗病寄主识别病原菌的重要靶标,揭示效应分子的生物学功能是研究病害互作机制的重要内容。因此,本论文应用微卫星分子标记技术,进一步明确了两个专化型的区别;采用多种显微技术详细观察了杨生褐盘二孢菌的附着、定殖和扩展等侵入过程;运用mRNA-Seq技术对两个专化型与亲和寄主互作过程中基因的转录表达进行分析;采用瞬时表达和酵母双杂等技术对专性效应分子做了研究,旨在明确杨生褐盘二孢菌的侵染、寄生特性,了解两个专化型与寄主杨树的互作机制,为抗病育种工作提供有价值的信息。主要研究结果及结论如下:1.开发了杨生褐盘二孢菌的微卫星分子标记,明确了两个专化型在遗传结构上的区别。通过分析杨生褐盘二孢菌的基因组发现该菌含有丰富的微卫星位点,继而经过引物设计和筛选获得了 24对微卫星引物并证实它们能够用于杨生褐盘二孢菌遗传多样性的研究。使用这些引物研究该菌的遗传多样性发现:两个专化型群体遗传结构的差异明显;同时,单芽管专化型比多芽管专化型具有更丰富的遗传多样性。研究结果进一步证实两个专化型的客观存在,并说明多芽管专化型可能由单芽管专化型进化而来。2.揭示了杨生褐盘二孢菌对杨树的组织病理侵入过程,阐明了其半活养的寄生特性。杨生褐盘二孢菌在寄主叶片表面形成侵染芽管,可直接从角质层侵入寄主。在侵染前期,该病菌主要以侵染泡囊和初生菌丝进行扩展,这些结构可突破寄主细胞壁,但不能穿过细胞膜,寄主细胞不发生死亡。在侵染后4 d,细长的次生菌丝大量出现,很多寄主细胞已经死亡,这些结果表明该菌是半活养型病原真菌,其寄生过程包含活养和死养两个阶段。此外,通过对侵染结构细节特征的观察发现,侵染芽管、侵染泡囊和次生菌丝等结构与寄主发生了明显的相互作用。3.发现两个派系杨树品种对杨生褐盘二孢菌侵染具有不同的响应方式。在杨树黑斑病的发生过程中,黑杨派和白杨派寄主分别有3301和4382个基因发生差异表达,这些基因涉及寄主的抗病蛋白、转录因子、信号转导、初生代谢和次生代谢等过程。维恩图分析和基因共表达趋势分析等表明,两个派系杨树品种在响应黑斑病菌侵染时表现出较大差异。黑杨派杨树在侵染初期(接种后6 h)有1543个基因发生上调表达,包括与细胞壁代谢、植物激素信号通路等生物过程相关的很多基因,说明其发生了较强的防御反应。与之不同,白杨派寄主在侵染初期反应较弱,只有526个基因发生上调表达;但在侵染后96 h该寄主响应强烈,有4093个基因发生了差异表达,其中有1773个基因发生下调表达,包括碳水化合物代谢、光合作用等生物过程相关的很多基因。此外,两个专化型可能通过影响亲和寄主不同生理过程完成寄生方式的转变。黑杨派寄主的类黄酮合成通路和苯丙素合成通路可能参与了多芽管专化型寄生方式的转变;而单芽管专化型可能通过引发白杨派寄主的过敏性细胞死亡实现寄生方式的转变。4.筛选到多芽管专化型的4个潜在专性效应分子。通过比对分析和软件预测获得156个杨生褐盘二孢菌的效应分子。其中,多芽管专化型菌株可能具有4个专性效应分子,分别为 MBM_02130、MBM_03364、MBM_02980 和 MBM_06785,它们在多芽管专化型的侵染过程中均发生显著上调表达;同时,这4个效应分子的表达均不能引发烟草的免疫反应,属于毒性效应分子。其中,MBM_02980和MBM_06785在死养阶段的表达量显著提高,说明它们可能在多芽管专化型杀死寄主组织的过程中起着重要的作用。此外,酵母双杂交试验结果表明MBM_06785可以同杨树的类S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因发生互作。
【图文】：

ＬＯＳＩＴＩＡＮ分析结果表明，２４对引物中有２３对引物位于中性区域，说明这２３逡逑对引物能够提供更可靠的遗传多样性信息，可以用于后续研究。其中，只有引物逡逑ＭＢＳ７３位于异常区域，在研究中应该选择性地进行使用（图２．４）。逡逑Ｆｓｔ／Ｈｅ逡逑ＭＢＳ７３．逡逑０邋１Ｖ逦：逡逑°＂＾ＢｒＴ逡逑００；邋＿Ｆ＾逡逑０邋００邋丨逦？邋？邋？邋？逡逑－００５：，＂邋＂ｒ／＂？逦，逦：逦：逡逑－ｏ邋ｉｏ逦．．趣二邋一；二：＿人逡逑０邋００逦０邋０５逦０１０逦０１５逦０邋２０逦０邋２５逦０邋３０逦０邋３５逦０邋４０逦０邋４５逦０邋５０逦０邋５５逦０邋６０逦０邋６５逦０邋７０逦０邋７５逦０邋８０逦０邋８５逦０邋９０逡逑Ｈｅ逡逑［？邋Ｍａｒｋｅｒｓ邋Ｃａｎｃｈｄａｔｅ邋ｂａｔａｎｃｎｇ邋ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ邋ＣａｎｔＭａｔｅ邋ｎｅｕｔｒａｌ邋—邋ＣａｒｘＸＭｅ邋ｐｏｓｉｔｉｖｅ邋ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ｜逡逑图２．４所^u发杨生褐盘二孢菌微卫星引物的ＬＯＳ１ＴＡＮ分析结果逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．４邋Ｔｈｅ邋ｒｅｓｕｌｔ邋ｏｆ邋ＬＯＳＩＴＡＮ邋ａｎａｌｙｓｅｓ邋ａｂｏｕｔ邋ｔｈｅ邋ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ邋ｐｒｉｍｅｒｓ邋ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ邋ｆｏｒ邋Ｍ邋ｂｒｕｎｎｅａ逡逑２．２．３杨生褐盘二孢菌微卫星引物的验证逡逑使用ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ分析预测北京和河南群体的遗传结构，将结果数据导入逡逑ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ邋ＨＡＲＶＥＳＴＥＲ进行最佳Ｋ值的评估分析。结果表明，，Ｋ值为２时ＤｅｌｔａＫ逡逑值最高，说明北京河南的４７个种菌株应该被划分为两个群体，这与菌株的采集背景逡逑相符

群体遗传结构图表明，北京和河南两个群体之间的遗传结构差异明显，同一群体逡逑菌株的遗传结构基本相同，只有６个个体的遗传结构与同地理群体的个体存在较大的逡逑差异（北京群体４个，河南群体２个）（图２．６）。这些结果证明２４对引物可以为该菌逡逑的遗传多样性提供较准确的信息，说明引物适用于杨生褐盘二孢菌遗传多样性研究。逡逑Ｂ．Ｊ逦ＨＮ逡逑图２．６北京和河南群体的遗传结构逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．６邋Ｔｈｅ邋ｇｅｎｅｔｉｃ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ邋ｆｒｏｍ邋Ｂｅｉｊｉｎｇ邋ａｎｄ邋Ｈｅｎａｎ逡逑依据菌株个体间的遗传距离进行聚类分析发现，４７个菌株共形成３个类群。其逡逑中，遗传距离较远的类群（红色方框标注）包含９个个体，其中有８个来自北京群体，逡逑只有１个来自河南群体。遗传距离较近的类群（蓝色方框标注）由１６个个体组成，逡逑包括１３个河南个体、３个北京个体；遗传距离居中的类群（橙色方框标注）包含２２逡逑个个体，由１０个河南个体和１２个北京个体组成（图２．７）。可见，北京个体间的遗传逡逑距离相对较远，具有更丰富的遗传多样性；而河南个体间的遗传距离相对比较近，个逡逑体间差异较小，遗传多样性较低。（图２．７）逡逑榻
【学位授予单位】：北京林业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S763.7


本文编号：2697594