山楂属植物中苹果褪绿叶斑病毒小RNA解析及其靶基因功能的研究

发布时间：2020-06-07 12:56

【摘要】：苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)是一种广泛侵染蔷薇科果树的RNA病毒,对经济性状具有严重影响。本研究首先利用高通量测序技术解析山楂属植物中ACLSV的全基因组序列;然后对感染ACLSV的山楂植株和健康植株进行转录组、小RNA组测序分析,明确ACLSV对山楂基因表达的影响,揭示源自ACLSV病毒小干扰RNA(vsiRNA)的组成和特性,预测山楂基因组中vsiRNA的潜在靶基因;最后通过转基因验证vsiRNA对山楂靶基因的转录后沉默作用及靶基因的生物学功能。主要研究结果如下:1.通过高通量测序技术获得了2个ACLSV山楂分离物SY02和SY03的基因组全长序列。利用RT-PCR方法对SY02序列进行分段克隆验证,结果显示分段克隆获得的序列与转录组拼接序列的一致性达99.70%,表明了转录组数据的可靠性。将2个分离物序列上传至NCBI,GenBank登录号分别为KU870524和KU870525。将ACLSV山楂分离物与GenBank中其他15个ACLSV分离物的核酸及氨基酸序列进行分析比对并构建进化树,发现ACLSV的亲缘关系远近与它们寄主种类具有相关性。2.感染ACLSV和健康的山楂植株叶片的转录组测序结果表明,两种材料之间有9910个基因差异表达(log_2 fold change≥1,padj0.01)。这些差异表达基因的KEGG功能聚类分析显示,“植物病原菌互作”是上调差异表达基因富集最显著的途径,“类黄酮生物合成”是下调差异表达基因富集最显著的途径。3.小RNA组测序表明,感染ACLSV的材料中存在源自病毒的小干扰RNA(vsiRNA),其中21 nt长度的vsiRNA数量最多,占total vsiRNA的59.83%;正义链vsiRNA占总的vsiRNA的51.80~54.28%;5?端首位碱基偏好性C≈A≈UG;热点区出现在复制相关蛋白的甲基转移酶、蛋白酶和解旋酶区域。4.对vsiRNA的靶基因进行了预测和功能注释,发现源自ACLSV的vsiR1360(-)靶向了山楂基因CpLRR-RLK1。并通过qRT-PCR、RLM-5?RACE和烟草瞬时转化试验证实了vsiR1360(-)能够沉默CpLRR-RLK1。5.从山楂中克隆出CpLRR-RLK1基因的全长序列,该基因CDS长度1794 bp,编码597个氨基酸。进化树分析显示CpLRR-RLK1属于LRR-RLK第II亚家族。亚细胞定位试验证明CpLRR-RLK1定位于细胞膜。通过qRT-PCR技术分析了CpLRR-RLK1基因的时空表达特性,表明该基因在山楂成熟叶片中表达量最高,嫩叶中表达量最低。克隆了CpLRR-RLK1基因的启动子并进行了序列分析,结果显示该基因启动子区域有很多防御和胁迫响应有关的顺式作用元件。6.构建了CpLRR-RLK1基因的过量表达载体,并通过农杆菌介导的遗传转化实现了山楂CpLRR-RLK1基因在苹果和拟南芥中的过量表达。获得了4个拟南芥阳性过表达株系,8个苹果过表达株系。山楂与苹果LRR-RLK1基因相似性高达96.77%,以苹果LRR-RLK1基因5?端特异性较强的395 bp序列作为RNAi干扰片段,构建MdLRR-RLK1基因的沉默载体并转化苹果,获得了17个沉默株系。7.对WT和转基因拟南芥接种Pst DC3000,由表型和胼胝质及ROS的测定结果,判断CpLRR-RLK1能够介导拟南芥对细菌的防御性;通过对?GL-3?对照和转基因苹果接种斑点落叶病菌和炭疽叶枯病菌,过表达株系的发病率和病情指数比对照低,沉默比对照高,表明CpLRR-RLK1对真菌的抗病性;将宿有ACLSV和ASGV的苹果试材与转基因苹果材料及对照?GL-3?进行试管苗微嫁接试验,病毒定性和定量检测都表明CpLRR-RLK1基因对ACLSV和ASGV具有一定的抑制作用。
【图文】：

基因组结构,叶斑病,病毒

病毒的检测效率，扩大了病毒检测范围，为果树病毒病的研究霓等（1999）通过双链 RNA（dsRNA）技术、RT-PCR 技术、隐病毒的生物学及生化特性。侯义龙等（2001）的研究指出 R灵敏度是传统的血清学检测方法 PAS-ELISA 技术的 8000 倍。叶斑病毒的病原性质及危害叶斑病毒是对果树危害最大的一类潜隐性病毒，属乙型线dae）纤毛病毒属（Trichovirus），并已知感染多种蔷薇科树种（MV 是一种正义的单链 RNA 病毒，长度大约在 640-760nm，由组成。病毒的 5 端有帽子结构，3 末端有 Poly(A)尾巴，5 和包含 3 个相互重叠的开放阅读框（Open Reading Frame，ORF）Replication-associated protein，Rep），运动蛋白（Movement proat protein，CP）三个蛋白（German et al., 1990; Sato et al., 1993CLSV 编码的唯一结构蛋白，序列相对保守，但其 N 端与 MP 变区，因此 CP 基因序列是ACLSV 株系划分的重要依据（郑银英

过程图,字形,过程,模型

S（effector-triggered susceptibility）。这便引发宿主植物产生针Resistance gene，R gene）编码的抗性蛋白（R 蛋白）来识别病效应因子（Wu et al., 2003）。这种由效应物促发的免疫叫效应s-triggered immunity，ETI），属于植物的第 2 层防御系统（El引起植物的高敏应答，导致侵染部位和周围细胞的快速死亡或物中传播。“基因对基因”假说描述了植物的第 2 层防御系统，抗病基因和与之相应的病原物的无毒基因结合时才得以表现2000）的实验证明水稻稻瘟病效应因子 Avr Pita 和抗性基因 Phashi 等（2002）的报道，拟南芥 RPP8/HRT 家族的 R 基因 RC性。Zhu 等（2017）的文章表明胞内免疫受体 Sw-5b 可以识别MP 的 21 个保守氨基酸的病毒效应基序进而对该病毒产生抗性进化过程中，病原菌也会突变或产生新的效应因子来逃避或者病原物的侵染性，而植物也会进化出新的 R 蛋白，再次激活基因对基因的相互作用中存在着一种竞争，同时也是一种平衡相互作用呈现 Z 字形的“拉锯战”局面（Jones and Dangl, 2006）（
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S436.619

【相似文献】