响应黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染的黄瓜miRNA功能分析及人工miRNA介导的病毒抗性评价

发布时间：2020-06-08 16:15

【摘要】：作为一种新的外来入侵有害生物,黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)是危害葫芦科(Cucurbitaceae)作物的重要病毒之一,由其引起的瓜类作物病毒病在生产中发生和危害日趋严重。该病毒病已对我国多个省市的葫芦科作物生产造成巨大经济损失,目前尚无针对该病毒病的抗病品种和高效的山间病害防治方法。本论文以CGMMV-黄瓜、CGMMV-本生烟互作的病害系统为研究对象,开展以下3个方面的研究:1)筛选CGMMV胁迫下黄瓜中稳定表达的内参基因,为miRNA表达特性分析提供可靠依据。2)挖掘参与黄瓜-CGMMV互作过程的miRNA及其靶基因,分析其表达特性,探究响应CGMMV侵染的黄瓜miRNA的功能和调控网络,为筛选黄瓜抗病基因提供新视角。3)通过人工miRNA技术特异性沉默CGMMV的功能基因,获得抗CGMMV的转基因本生烟(Nicotianabenthamiana)植株,为培育抗病品种提供新思路。主要研究结果如下:1)CGMMV胁迫下黄瓜miRNA定量表达中内参基因的筛选。采用RT-qPCR方法对Actin、Tubulin、EF-1α、18SrRNA、Ubiquitin、GAPDH和 Cyclophilin 共 7 个内参基因在 CGMMV 侵染的黄瓜植株叶、茎和根中的表达水平进行了检测。使用delta-Ct、geNorm、NormFinder、BestKeeper以及在线工具RefFinder等对内参基因的表达稳定性进行了分析和评价,并在miR159等多个黄瓜miRNA上验证了上述内参基闪的表达稳定性。结果表明:EF-1α在黄瓜叶片和根中是最稳定的可用于标准化miRNA表达的内参基因,在系组织中,GAPDH表达最为稳定,而Ubiquitin和EF-1α则是最适合所有类型样品的内参基因组合。2)响应CGMMV侵染的黄瓜miRNA功能分析。通过降解组测序和生物信息学分析,获得了响应CGMMV侵染的47个黄瓜miRNA家族和3046个靶标转录本信息。采用实时定量PCR、Northern blot和5'-RLM-RACE等方法,对参与植物-病原物互作、植物激素信号转导等生物过程的部分黄瓜miRNA及其靶基因的表达特性、剪切位点等进行分析和验证,结果表明:10个黄瓜miRNA及其调控的11个靶基因的表达水平在CGMMV接种后12 h～15 d的叶片样品中发生了不同程度的差异表达,其中miRl 72与其靶基因XM011656616.1、miR3 93与其靶基因NM001280617.1以及miR858与其靶基因XM004140251.2等的表达呈负相关关系;miRNA与其靶标mRNA的剪切作用发生在miRNA成熟序列5'端开始的第10位核苷酸处。此外,构建了 miRNA-靶基因-下游生物过程之间紧密联系的调控网络,其中黄瓜miR159靶向应对生物和非生物胁迫的正调控因子丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PBS,csa-miRn6-3p可调控钙依赖蛋白激酶CPK32,进而参与植物抗病反应。3)人工miRNA介导的病毒抗性评价。构建了分别靶向CGMMV外壳蛋白(coat protein,CP)、移动蛋白(movement protein,MP)和复制酶(replicase,Rep)基因保守序列的6个人工miRNA表达载体,采用农杆菌介导的遗传转化法获得过表达人工miRNA的转基因本生烟植株。结果显示,表达高水平的amiR1-CP、amiR4-MP和amiR6-Rep的转基因植株表现出一定程度的病毒“抗性”或“耐受性”,可减少病毒复制,降低发病率。表达低水平的amiR2-CP的转基因植株,或表达中等水平的amiR3-MP和amiR5-Rep的转基因植株则易受到CGMMV侵染的影响,并表现出花叶、斑驳等病毒病的症状。综合分析得出,靶向CGMMV CP基因的人工miRNA介导的抗性水平最高。上述结果证明了应用人工miRNA介导的基因沉默技术有助于保护植物免受病毒病的危害。
【图文】：

序列,调控机制,生物合成,植物

２００９）。逡逑１．２．３植物ｍｉＲＮＡ的作用机制逡逑如图１－７所示，植物ｍｉＲＮＡ主要通过两种转录后基因沉默（Ｐｏｓｔ邋ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ邋ｇｅｎｅ逡逑ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ，ＰＴＧＳ）方式调控下游基因表达，即剪切与其序列反向互补的靶标ｍＲＮＡ或抑制靶标逡逑ｍＲＮＡ的翻译（Ｌｉｕ扣ａ／．，邋２０１７）。一方面，当植物ｍｉＲＮＡ与靶标ｍＲＮＡ的序列完全或几乎完逡逑全互补（仅０￣５个错配碱基）时，ｍｉＲＮＡ在ＲＩＳＣ、ＨＡＳＴＹ等的作用下剪切下游靶标ｍＲＮＡ逡逑从而将其降解。Ｌｌａｖｅ等（２００２）采用５＇－ＲＡＣＥ实验技术检测切割后的ｍＲＮＡ片段，证实了逡逑ｍｉＲＮＡ可在其序列的第１０？１１位之间对反向互补的耙标ｍＲＮＡ序列进行特异性切割。另一方逡逑面，当植物ｍｉＲＮＡ与祀标ｍＲＮＡ的序列不完全互补时，ｍｉＲＮＡ则通过抑制耙标ｍＲＮＡ翻译逡逑进行下游基因的表达调控。除上述两种主要的作用机制外，植物ｍｉＲＮＡ对其靶基因的第三种逡逑作用机制是基于ＤＮＡ和组蛋白的甲基化，从而在转录水平对其进行调控，进而引起靶基因的逡逑转录后沉默（Ｋｈｒａｉｗｅｓｈｅｆａ／．

流程图,文库构建,流程,植物病害

中国农业大学博士学位论文逦第一章引言逡逑个重要方向和热点。越来越多的研究揭示出ｍｉＲＮＡ在植物病害发生、发展中处于重要位置，逡逑很多研究课题或多或少都会涉及ｍｉＲＮＡ领域，而了解ｍｉＲＮＡ基本研究思路及方法是研究中不逡逑可缺少的重要步骤。逡逑ｍＲＮＡ邋－邋ｔａｒｇｅｔ邋ｏｆ邋ｍｉＲＮＡ
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S436.421

【参考文献】