光肩星天牛四跨膜蛋白AglaTSP先天性免疫功能鉴定

发布时间：2020-06-09 04:13

【摘要】：光肩星天牛(Anoplophora glabripennis)是林木蛀干害虫之一,给世界林业生产和生态环境造成严重的危害。为了深入了解光肩星天牛先天性免疫机制,本研究对前期克隆到的四跨膜蛋白AglaTSP参与光肩星天牛先天性免疫的作用进行了初步鉴定。首先利用生物信息学方法分析光肩星天牛四跨膜蛋白AglaTSP的序列特征,再利用球孢白僵菌(Beauveria bassiana)孢子及孢子裂解物、苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)及其裂解物对光肩星天牛成虫进行免疫诱导后,采用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)、RNA干扰(RNA interference,RNAi)等技术检测AglaTSP以及其他5种免疫相关蛋白基因的相对表达量以及酚氧化酶活性,同时监测免疫干扰导致的试虫活性变化,最后根据昆虫免疫相关通路及实验结果模拟绘制AglaTSP参与的光肩星天牛免疫代谢通路流程图。主要结果如下:(1)AglaTSP具有典型的四跨膜蛋白结构,包含有CCG(Cys-Cys-Gly)和GC保守序列。AglaTSP在进化上相对保守,但与其它家族成员相比,相互之间序列相似度不高。Blastx分析发现AglaTSP属于CD63亚家族。KEGG通路分析预测AglaTSP为CD63抗原,参与ko04142(溶酶体)途径。(2)用四种免疫干扰剂对光肩星天牛成虫进行免疫诱导,检测AglaTSP基因表达量变化。与对照相比,24h内AglaTSP基因相对表达量均有极显著上调(P0.01),特别是经球孢白僵菌孢子悬浮液干扰后6h,AglaTSP的基因表达量极显著上调(P0.01),干扰18h后表达量上调至最高;白僵菌孢子裂解物免疫诱导试虫6h后,AglaTSP基因表达量相对CK显著增高(P0.05),18h后表达量极显著增高(P0.01);苏云金杆菌及菌裂解物免疫诱导12h后,AglaTSP基因相对表达量达极显著上调(P0.01)。(3)根据AglaTSP基因序列特异性片段设计合成AglaTSP dsRNA,对光肩星天牛成虫进行RNAi 48h后,试虫体内AglaTSP基因的相对表达量出现极显著下调(P0.01),到72h后RNAi沉默效率达到最高(沉默效率66.5%)。(4)利用四种免疫干扰剂分别对RNAi前后的光肩星天牛进行免疫诱导,监测24h内试虫死亡率,结果表明,在24h内,未进行RNAi的试虫和RNAi后注射无菌水的试虫死亡率均为0,而AglaTSP RNAi试虫被免疫干扰剂干扰后,均有死亡现象:苏云金杆菌免疫干扰RNAi试虫,12h死亡率到达100%,裂解物干扰18h后试虫死亡率达到100%;白僵菌孢子及孢子裂解物侵染24h后试虫死亡率分别达到50%和40%。(5)以注射无菌水作为对照,免疫诱导AglaTSP RNAi和未经RNAi的光肩星天牛,发现试虫酚氧化酶活性发生显著变化,未沉默AglaTSP的试虫酚氧化酶活性表现出先升高后降低的趋势,苏云金杆菌及其裂解物诱导RNAi试虫3h,酶活性达到极显著增高(P0.01),随后下调,至12h酶活与对照无显著差异(P0.01)。每组处理AglaTSP RNAi后光肩星天牛的酚氧化酶活性最高值均极显著低于没有进行RNAi样本的酶活最高值(P0.01),说明AglaTSP参与光肩星天牛免疫激活酚氧化酶原。利用qRT-PCR检测AglaTSP RNAi前后光肩星天牛中相关基因的表达量。结果表明,RNAi AglaTSP基因表达对肽聚糖识别蛋白和β-1,3-葡聚糖识别蛋白的识别影响不显著,其余三种功能蛋白基因的表达量极显著低于未进行RNAi的试虫。AglaTSP在天牛免疫反应中参与接受信号识别蛋白识别的“非己”物质入侵信号,并将信号传递给信号调节相关蛋白。(6)结合有五种蛋白参与的昆虫免疫KEGG通路以及上述实验结果,对AglaTSP的作用位点定位,绘制有四跨膜蛋白AglaTSP参与的光肩星天牛相关免疫通路,AglaTSP于信号识别分子及信号调制分子之间行使功能。综上所述,四跨膜蛋白AglaTSP参与光肩星天牛先天性免疫调节,将识别分子发出的入侵信号传递给信号调制分子。本研究对深入了解光肩星天牛应对侵染的免疫分子机制和生态适应机制具有重要意义,同时为天牛科害虫的无公害防治提出新的策略和靶点奠定基础。
【图文】：

1.1.2 四跨膜蛋白功能研究进展四跨膜蛋白特殊的蛋白结构能够使其作为通道连接细胞膜内外信号，参与生物体的多种生命活动。1997 年，，四跨膜蛋白的功能首次被 Maecker 诠释，随后有关其功能的报道逐渐增多[15]。四跨膜蛋白分子能够影响生物体磷酸肌醇依赖性信号转导，进而影响细胞生长、囊泡运输和许多细胞信号转导等过程[16]。如 CD37 可以直接参与导致细胞凋亡的信号转导[17]。CD63 在小鼠胚胎发育和着床过程中发挥重要作用[18]，小鼠四跨膜蛋白CD9 在卵细胞表面表达，对小鼠的精卵融合至关重要[19]。绵羊卵母细胞中的四跨膜蛋白 CD9 损伤会降低受精率[20,21]。线虫（Caenorhabditis Elegans）四跨膜蛋白 TSP15是其蜕皮行为及表皮发育所必需的[22]，拟南芥（Arabidopsis thaliana）的 17 种四跨膜蛋白中，有多个与其生长发育有关[3]，香蕉四跨膜蛋白 MaTET 影响果实的成熟[23]。

免疫调节中担任什么角色？它的作用机制是怎样的？这些都需要进行深入研究。本研究以光肩星天牛四跨膜蛋白 AglaTSP 为研究对象，利用生物信息学、实时荧光定量 PCR（Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）、RNA 干扰（RNAinterference, RNAi）等试验方法进行光肩星天牛先天性免疫的相关探索，为深入解析光肩星天牛应对病原菌侵染的免疫分子机制具有重要意义。技术路线：
【学位授予单位】：河北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S763.38

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4 秦

本文编号：2704145