基于酶学响应及代谢组变化的根腐病菌Fusarium spp.-黄芪互作研究

发布时间：2020-06-12 18:46

【摘要】：黄芪根腐病的发生是严重制约黄芪产业持续发展的重要因素之一,培育和利用抗病品种是防治黄芪根腐病最为经济、有效的手段。本论文以黄芪—根腐病优势致病菌为研究体系,对致病菌细胞壁降解酶的产生和植物防御酶系统的激活进行研究,并基于~1H NMR代谢组学技术分析互作过程中代谢物谱的整体变化,以期为针对黄芪根腐病的抗病育种和发现新的互作机制提供依据与思路。(1)以根腐病优势致病菌Fusarium acuminatum、F.solani和F.oxysporum为研究对象,对其活体外诱导和黄芪回接致病后细胞壁降解酶(CWDEs)的动态变化,采用分光光度法进行测定分析。结果表明:在活体诱导条件下,3种根腐病菌均可产生多聚半乳糖醛酸酶(PG)、聚甲基半乳糖醛酸酶(PMG)、果胶甲基反式消除酶(PGTE)、多聚半乳糖醛酸反式消除酶(PMTE)、羧甲基纤维素酶(Cx)和β-葡萄糖苷酶(βG)。其中,F.acuminatum产生PG、PMG、βG和PMTE的能力最强;F.solani产生PGTE的能力明显高于其他两种病菌;Cx的产生能力F.acuminatum和F.oxysporum强于F.solani。致病回接试验中,选取活体外诱导产生的主要酶PG、PMG、Cx和βG进行测定。结果显示,F.solani产生PMG的能力较为突出;F.acuminatum产生PG和Cx的能力优于其他两种菌;F.oxysporum则具有较强分泌βG的能力。上述结果说明,不同根腐病菌在活体外产生CWDEs的能力有所差异;侵染黄芪过程中各自分泌CWDEs的能力也不相同,说明3种根腐病菌具有不同的致病机制。(2)将在山西省致病性强、分布广、且分离频率高的根腐病菌F.solani和F.acuminatum,采用幼苗浸根法接种黄芪,分光光度法测定其发病过程中苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性变化。结果表明,F.solani侵染黄芪后,PAL活性随发病程度的加深逐渐降低,且明显低于对照;PPO活性在侵染前期与对照组差异不明显,在侵染后期却显著低于对照;POD酶活水平虽稍高于对照组,但其活性在不同时间段无显著变化;SOD活性随时间的延长显著增加,且明显高于对照。上述结果说明:F.solani侵染黄芪后不能激活PAL、PPO和POD的活性,但SOD的活性的明显升高意味着活性氧清除系统能够可能被激活。F.acuminatum侵染黄芪后,PAL、POD、PPO和SOD这4种防御酶的活性均随发病程度的加深呈先升高后降低的趋势,且酶活水平明显高于对照。其中,SOD活性在7 d时达到高峰,POD在14 d时达到酶活峰值,PAL和PPO酶活均在21 d时达到最大值。说明F.acuminatum侵染激活了上述各防御酶的活性,但其活性高峰出现的时间并不相同。可见,由于致病机制的不同,这两种病菌在侵染过程中引发的植物抗病机制也有差异。(3)以山西黄芪根腐病最重要的致病菌F.solani为研究对象,盆栽灌根法接种黄芪,以未接种的健康植株为对照,不同时间点采集样品,采用~1H NMR代谢组学技术对黄芪发病过程中代谢物种类和含量的动态变化进行测定,通过PCA和OPLS-DA相结合的多元统计分析方法,寻找出13种差异代谢物。其中,氨基酸类差异代谢物为缬氨酸、精氨酸、苏氨酸、氨基丁酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸和苯丙氨酸;有机酸类差异代谢物为柠檬酸、牛磺酸和苹果酸;糖类差异代谢物为果糖和蔗糖。对上述代谢物含量变化与根腐病发病情况进行相关性分析,找出与根腐病发生最为相关的8种代谢物,并对其进行验证,确定黄芪抗病指示物可能为天冬氨酸、苯丙氨酸、蔗糖和果糖,感病指示物可能为谷氨酰胺。
【图文】：

图 1-1 实验流程图1.2.2 本课题的主要创新点本课题的创新之处为：(1)选题上，首次以山西黄芪根腐病菌(F. acuminatum、F. solani 和 F. oxysporum)和黄芪互作体系为对象，进行互作机制研究。(2)思路上，以生理互作过程中的酶学响应和代谢组学变化为切入点，阐释根腐病菌与黄芪的互作机制。(3)方法上，首次利用基于1H NMR 的代谢组学技术，分析根腐病菌 F. solani 与黄芪互作过程中代谢物谱的整体变化，指认相关的感病/抗病代谢产物。

3.2.6.2 紫外分光光度法测定 PGTE 和 PMTE 活力PGTE 和 PMTE 活性测定[55]：在 1.0 mL 酶液加入 1.0 mL 甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(0.05 mol/L，pH 9.0)和 1 mL 底物(PGTE 的底物为多聚半乳糖醛酸，，PMTE 的底物为果胶)，再加入 1.0 mL 3 mmol/L CaCl2后，再在 30 ℃下水浴反应 10 min，最后取 mL 在 OD232nm 处测定反应前后的活性。3.2.7 数据分析应用 SPSS 17.0 软件中的 Duncan 氏新复极差法来分析各组间的差异显著性。3.3 结果与分析3.3.1 标准曲线的制作3.1.1.1 葡萄糖和 D-半乳糖醛酸标准曲线葡萄糖、D-半乳糖醛酸与 DNS 试剂反应后，测定 OD540nm值，并制作标准曲线葡萄糖标曲方程为：y = 7.63x - 0.35，R2= 0.999 (图 3-1)；D-半乳糖醛酸的标曲方程为：y = 7.04x - 0.04，R2= 0.994 (图 3-2)。
【学位授予单位】：山西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S435.672

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本文编号：2709948