百合无症病毒16kDa蛋白分析、纯化及RNA沉默响应分析

发布时间：2020-06-13 10:11

【摘要】：百合无症病毒(LSV)是危害百合科植物主要病毒,属于香石竹潜隐病毒属(Carlavirus),该病毒寄主范围较窄,只侵染百合科植物,目前尚未有有效办法进行根治。LSV是单正链RNA病毒,全长8394bp,具有6个开放读码框,编码4个蛋白分别为RbRp,TGB1-3,CP,16kDa。其中LSV-16kDa是功能未知蛋白,查阅文献推测可能是基因沉默基因,与RNA沉默机制相关。本论文在前期研究的基础上,通过生物信息学和分子生物学等手段,分析LSV-16kDa蛋白与RNA沉默过程中关键蛋白的互作关系,进而阐明LSV-16kDa蛋白功能,为彻底根治LSV致病机理奠定基础。研究结果如下:通过与韩国,日本,中国浙江等地LSV-16kDa序列Blast比对分析,LSV-16kDa非常保守,具有Carla4家族核酸结合功能域,说明在基因组中是关键功能基因。磷酸化分析得知其存在磷酸化调控的可能性,糖基化位点分析发现LSV-16kDa存在N-糖基化和O-糖基化位点;多重算法预测LSV-16kDa二级结构N端为α-helix-coil-α-helix结构。Swiss model网站同源建模,对建模结果进行质量评估,所建同源模型蛋白质空间分布合理。同源建模LSV-16kDa的N端结构域,为无规则卷曲连接的2段α-螺旋,该结果与多重算法计算结果一致。N端结构域的α-helix-loop-α-helix结构中碱性氨基酸位于2段α-螺旋上,可通过氢键及静电力与核酸结合,α-螺旋上的亮氨酸拉链结构可通过绞连,进一步与siRNA互作,推测LSV-16kDa具有沉默抑制子功能基础。将关键位点碱性氨基酸进行突变,命名为LSV-Δ16kDa。将LSV-Δ16kDa,LSV-16kDa同时添加纯化标签,去除终止密码子,转入原核载体进行表达并优化表达条件,获得可溶的LSV-16kDa及LSV-Δ16kDa蛋白。通过Western Blot特异性分析证明所表达的蛋白为目标蛋白LSV-16kDa及LSV-Δ16kDa,使用层析镍柱将目标蛋白纯化。LSV-16kDa与绿色荧光蛋白融合构建入真核双源表达载体PBI121,转化入农杆菌GV3101。激光共聚焦显微镜观察LSV-16kDa定位于细胞核,此为沉默抑制子关键因素。生理检测发现受感染的植株,POD,SOD,PAL活性均迅速上调,以抵抗LSV-16kDa侵染;同时病程相关基因HSP90及PR1均上调表达,其中HSP90随侵染时间表达量上调;而PR1随侵染时间表达量下降。研究RNA沉默机制中关键基因发现,AGO和DCL均出现上调,AGO2比AGO1,AGO4响应较快;DCL2比DCL1,DCL3响应较快,推测AGO2,DCL2均为RNA沉默中与LSV-16kDa互作的关键通路。
【学位授予单位】：大连理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S436.8

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本文编号：2711020