中国野生毛葡萄转录因子WRKY及bZIP表达与调控抗病研究

发布时间：2020-06-13 15:49

【摘要】：葡萄是世界性果树,其果实用于鲜食、酿酒、制汁以及制干,具有巨大的经济价值。葡萄中的白藜芦醇作为葡萄中重要的植保素,不仅可以促进植物抗各种生物与非生物胁迫,而且在人体中可以发挥抗癌、抗氧化、保护心血管等功能。中国野生毛葡萄丹凤-2(Vitis quinquangularis accession Danfeng-2)抗病性强,白藜芦醇含量高。本研究以中国野生毛葡萄丹凤-2为材料,筛选调控芪合成酶(Stilbene synthase,STS)基因表达的WRKY及bZIP转录因子。分析转录因子的基因结构,表达模式及对STS基因的调控方式。揭示中国野生毛葡萄丹凤-2携带的转录因子基因具有调控STS基因表达与促进植物抗病的作用,为今后利用这个特异野生葡萄资源进行抗病育种提供理论依据。取得主要结果如下:1、利用qRT-PCR研究了中国野生毛葡萄丹凤-2在接种白粉菌条件下,59个WRKY转录因子成员的表达差异。其中有19个WRKY成员包括VqWRKY2,VqWRKY3,VqWRKY6,VqWRKY7,VqWRKY10,VqWRKY18,VqWRKY21,VqWRKY23,VqWRKY26,VqWRKY27,VqWRKY28,VqWRKY29,VqWRKY30,VqWRKY31,VqWRKY32,VqWRKY48,VqWRKY49,VqWRKY52,VqWRKY53在白粉菌诱导下上调表达。利用同源克隆的方法,在丹凤-2中克隆得到VqWRKY2,VqWRKY3,VqWRKY9,VqWRKY24和VqWRKY53的编码序列,分别为1779bp,570bp,780bp,582bp和456bp。NCBI登录号分别为:VqWRKY2(MN240478),VqWRKY3(MN240479),VqWRKY9(MN240480),VqWRKY24(MN240481),VqWRKY53(MN240482)。VqWRKY2属于WRKY转录因子家族的groupⅡb亚家族,VqWRKY3,VqWRKY24和VqWRKY53属于groupⅡc亚家族,VqWRKY9属于groupⅡa亚家族。同时,克隆得到VqWRKY2,VqWRKY3,VqWRKY9,VqWRKY24和VqWRKY53的启动子序列并进行元件分析。通过PEG介导转化拟南芥原生质体进行亚细胞定位分析,结果表明VqWRKY2,VqWRKY3,VqWRKY9,VqWRKY24和VqWRKY53均定位于细胞核内。2、在接种葡萄白粉菌和外源处理flg22,H_2O_2,CaCl_2情况下,利用qRT-PCR分析WRKY转录因子以及STS基因的表达模式。结果表明,在白粉菌接种后VqWRKY2,VqWRKY3,VqWRKY53和STS基因表达量升高,而VqWRKY9和VqWRKY24下调表达。在flg22处理下,VqWRKY3,VqWRKY9,VqWRKY53和STS基因受flg22诱导表达量显著提高。在H_2O_2处理下,VqWRKY2,VqWRKY3,VqWRKY9,VqWRKY24,VqWRKY53和STS表达量都显著提高。在CaCl_2处理下,仅有VqWRKY53与STS表达量上调。VqWRKY3,VqWRKY9以及VqWRKY53对flg22的响应需要经由活性氧爆发和MAPK级联途径。3、对中国野生毛葡萄丹凤-2的叶片进行外源激素SA,ABA,Eth和MeJA处理。利用qRT-PCR,分析WRKY转录因子以及STS基因对激素信号的响应模式。结果表明,VqWRKY2,VqWRKY3,VqWRKY53以及STS在SA,ABA,Eth和MeJA的诱导下上调表达。VqWRKY9在SA,ABA以及MeJA的诱导下表达量提高。VqWRKY24在SA的诱导下表达量上调。4、通过酵母双杂交和双分子荧光互补实验证明VqWRKY3与VqMYB14蛋白互作,VqWRKY53和VqMYB14,VqMYB15两个转录因子分别互作。以丹凤-2的gDNA为模版,克隆得到VqSTS9,VqSTS16,VqSTS32,VqSTS41和VqSTS48的启动子,序列分析表明这5条STS启动子序列均包含WRKY和MYB转录因子结合位点。酵母单杂交实验证明,VqWRKY2可以结合VqSTS9,VqSTS32,VqSTS41和VqSTS48的启动子。VqWRKY3可以结合VqSTS16和VqSTS48的启动子。VqWRKY9和VqWRKY24可以结合VqSTS9,VqSTS16,VqSTS41和VqSTS48的启动子。VqWRKY53可以结合VqSTS9,VqSTS16和VqSTS41的启动子。5个WRKY转录因子均可以结合TTGACC元件,而只有VqWRKY9和VqWRKY53可以结合TTGACT元件。5、利用GUS活性定量实验进一步验证WRKY转录因子对STS启动子的影响。结果表明,VqWRKY2、VqWRKY9分别可以上调VqSTS9,VqSTS16,VqSTS32,VqSTS41和VqSTS48启动子活性。VqWRKY3可以上调VqSTS32和VqSTS48启动子活性。VqWRKY24可以上调VqSTS16,VqSTS32,VqSTS41和VqSTS48启动子活性。VqWRKY53可以上调VqSTS9,VqSTS16,VqSTS32,VqSTS41启动子活性。共表达VqWRKY3与VqMYB14可以上调VqSTS9,VqSTS16,VqSTS32和VqSTS41启动子活性。但是相对于单独转化VqWRKY3,共表达VqWRKY3与VqMYB14降低了对VqSTS48的启动子活性。共表达VqWRKY53与VqMYB14或VqMYB15可以在不同程度上调STS启动子活性。在丹凤-2的叶片中瞬时过量表达WRKY转录因子,STS基因的表达量提高。利用高效液相色谱对芪类物质的含量进行测定,发现过量表达WRKY转录因子提高反式白藜芦醇及反式云杉新苷的含量。异源过量表达VqWRKY2可以经由JA途径提高拟南芥对丁香假单胞杆菌的抗性。异源过量表达VqWRKY53可以引起AtSAG12表达量升高,活性氧积累,SA含量升高,促进叶片衰老。过量表达VqWRKY5还可以经由SA途径增强拟南芥对丁香假单胞杆菌的抗性。6、利用同源克隆的方法,从丹凤-2中克隆得到VqbZIP1。VqbZIP1的编码序列全长为900bp,编码299个氨基酸。GenBank登录号为:AXN75965.1。qRT-PCR结果表明,VqbZIP1在葡萄的各个组织器官中均有表达,其表达量在成熟果实中最高。VqbZIP1对ABA,Eth和MeJA的响应较为显著。VqbZIP1同样响应白粉菌诱导以及CaCl_2和H_2O_2小分子信号。亚细胞定位和酵母转录激活实验证明,VqbZIP1定位于细胞核并且在酵母中具有转录激活活性。通过酵母双杂交与双分子荧光互补实验证明VqbZIP1与ABA信号通路上的核心元件VqSnRK2.4和VqSnRK2.6互作。序列分析表明VqSnRK2.4和VqSnRK2.6基因分别位于7号和3号染色体上,分别与拟南芥中的AtSnRK2.4和AtSnRK2.6同源性最高。亚细胞定位表明,VqSnRK2.4和VqSnRK2.6在细胞质,细胞核以及细胞膜上都有存在。在ABA激素诱导下,VqSTS6,VqSTS16,VqSTS20,VqSnRK2.4和VqSnRK2.6都出现不同程度的上调表达。以丹凤-2的gDNA为模版,克隆VqSTS6,VqSTS16,VqSTS20的启动子序列,对其进行顺式作用元件分析,3条启动子序列均含有响应ABA信号的ABRE顺式作用元件。将启动子构建到pC0380-GUS载体,GUS活性定量实验表明,VqbZIP1可以激活VqSTS6,VqSTS16,VqSTS20的启动子活性。相对于单转VqbZIP1,共表达VqbZIP1与互作基因VqSnRK2.4和VqSnRK2.6可以更大幅度的激活STS启动子活性。在丹凤-2的叶片中过量表达VqbZIP1,通过qRT-PCR和HPLC实验证明过量表达VqbZIP1可以上调STS基因表达总量以及VqSTS6,VqSTS16,VqSTS20的表达量,引起白藜芦醇与云杉新苷的含量增高。异源过量表达VqbZIP1可以增加拟南芥对ABA的敏感性,上调ABA信号通路的关键基因。综上所述,中国野生毛葡萄转录因子VqWRKY2,VqWRKY3,VqWRKY9,VqWRKY24和VqWRKY53以及VqbZIP1参与正向调控芪合成酶基因的表达,促进植物的抗病性。
【图文】：

杉醇 (Bavaresco et al. 2002)。在正常的条件下，芪类物质在低水平，但是会在多种生物和非生物胁迫下在植物体内大物质可以响应多种病原菌侵染包括：白粉病 (Fung et al. 20病 (Langcake & Pryce 1976)，灰霉病 (Adrian et al. 1997; Beavaresco et al. 2003; Vezzulli et al. 2007)。的合成经由苯丙氨酸代谢途径，芪合成酶（Stilbene syntha芦醇合成的最后 步催化酶最早是从花生的悬浮细胞nd Kindl 1984)。在苯丙氨酸途径中，首先苯丙氨酸经由苯丙。肉桂酸进 步被肉桂酸-4-羟化酶（Cinnamate-4-hydroxy。紧接着香豆酸裂解酶（4-cumaroyl, 4CL）裂解香豆酸生成尔酮合成酶（Chalcone synthase ,CHS）和芪合成酶竞争底个分支。其中查尔酮合成酶催化合成黄酮类物质，而芪合酶 A 和 分子的香豆酸辅酶 A 合成芪类物质白藜芦醇 (

第二章 中国野生毛葡萄 WRKY 转录因子调控芪类物质合成与抗病研究生毛葡萄丹凤-2 的叶片进行白粉菌接种，并在接种后的 0 、12 、24 、48、72、行 qRT-PCR 分析。此处选用 GAPDH 做为内参基因，表达量的误差（SD）取自-1 Expression analysis of WRKY transcription factors in Chinese wild Vitis quinquangresponse to powdery mildew infection.f Danfeng-2 were inoculated with powdery mildew and samples were collected at 0, d 120 h after inoculation for qRT-PCR. GAPDH was used here as an internal reference bar (SD) was calculated from three biological replicates.
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S436.631

【参考文献】

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1 段朝辉;中国葡萄野生种白藜芦醇含量分析的研究[D];西北农林科技大学;2002年

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本文编号：2711398