取食二斑叶螨为害菜豆的西花蓟马转录组分析

发布时间：2020-06-13 19:49

【摘要】：西花蓟马Frankliniella occidentalis是农业和园艺上的重要害虫,为典型的锉吸式口器害虫,为害严重,造成重大的经济损失。二斑叶螨Tetranychus urticae与西花蓟马同为菜豆上的重要害虫,且常常同时发生共同危害寄主植物。本文旨在研究西花蓟马和二斑叶螨为害后菜豆不同部位叶片防御酶活性的变化,以揭示菜豆植株的系统抗性。并通过转录组(RNAseq)分析西花蓟马取食二斑叶螨为害的菜豆植株第1代和第7代后的差异,揭示西花蓟马适应菜豆诱导抗性的分子机制。以期为进一步研究西花蓟马与二斑叶螨的竞争,以及为西花蓟马的综合治理奠定基础。主要研究结果如下:1、西花蓟马和二斑叶螨取食对菜豆防御酶活性的影响分别以西花蓟马和二斑叶螨取食,以及机械损伤处理菜豆中部叶片6 h、24 h、48 h、72h和96 h后,测定菜豆植株中部处理叶片以及上部和下部未处理叶片的抗氧化酶和防御酶活性的变化。1.1、对抗氧化酶POD、CAT和SOD活性的影响西花蓟马和二斑叶螨取食以及机械损伤处理后,过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性在处理的菜豆中部叶片发生了明显变化,但西花蓟马和二斑叶螨造成酶活性的变化趋势不同。与对照相比,中部叶片POD活性不论在何种处理下均是先升高后恢复至对照水平。POD活性在二斑叶螨取食24 h时最先达到最大值,而对机械损伤和西花蓟取食的响应较迟,直到48 h后才达到峰值。中部叶片CAT活性对机械损伤和2种害虫取食的响应存在差异,机械损伤24 h时CAT活性明显升高,而CAT活性对2种害虫取食的应答较早,6 h明显升高,但随时间的延长,CAT活性的变化趋势不同。中部叶片SOD活性在不同处理下变化较大,在机械损伤诱导下仅在96 h明显升高;二斑叶螨取食24h以后SOD活性均明显升高;但西花蓟取食后,SOD活性在一定时间内受到明显的抑制。3种酶活性在处理植株未受害的上部和下部叶片也发生了明显的变化,不同处理后在上部未受害叶片中POD活性被抑制或被激发,而在下部叶片不同处理下均升高。CAT活性不论在上部还是下部未受害叶片,在不同处理的某些时间下均被明显激发。SOD活性在机械损伤以及二斑叶螨取食后的上部和下部未受害叶片一定时间内均被明显激发。但SOD活性在西花蓟马取食后,在一定时间内被抑制。1.2、对防御酶PPO和PAL活性的影响西花蓟马和二斑叶螨取食及机械损伤处理后,中部受害叶片的多酚氧化酶(PPO)活性均是在6 h明显升高,但随时间的延长,不同诱导处理下PPO活性的变化不同。苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性经机械损伤处理48 h后被明显激活,而二斑叶螨和西花蓟马取食后,中部叶片PAL活性应答较早,分别在6 h和24 h被诱导明显升高,且分别达到活性最大值,为对照的1.8和2.8倍。上部和下部未受害叶片在2种害虫取食后PPO活性均在6 h明显升高;但机械损伤处理后,上部叶片PPO活性在48 h才被明显激活。PAL活性在机械损伤处理下,也发现菜豆上部和下部叶片被激活的时间也均较害虫取食晚;且害虫中以二斑叶螨取食后PAL活性激活最快,上部和下部叶片均在6 h达到最大值,分别为对照的2.8和5.1倍。以上结果说明害虫取食菜豆叶片产生系统防御,并且菜豆植株的系统防御与害虫种类有关。2、西花蓟马转录组分析利用BGISEQ-500转录组技术对菜豆豆荚、健康菜豆植株和二斑叶螨危害植株饲养的西花蓟马种群进行RNA-seq测序和分析,共获得102,696个Unigenes基因,其中有56.55%的基因在数据库中获得注释(58,077个),在KOG、GO和KEGG数据库中分别有42,155、7,495和42,740个基因获得注释。其中信号转导机制最多有10,139个Unigenes基因,碳水化合物转运和新陈代谢以及次级代谢产物生物合成有3,069个,运输和分解代谢注释上的基因有1,049个,防御机制有3,402个。大部分差异基因富集在生物过程和细胞组分中的26和20个terms板块,分别有15,108和13,399个。Pathway代谢通路分析发现,在传染性病害、代谢和免疫系统相关通路富集有大量基因,参与西花蓟马适应寄主抗性的生长和发育过程。2.1、西花蓟马取食不同处理菜豆植株的差异基因表达分析以健康植株和二斑叶螨为害的菜豆植株分别饲养西花蓟马第1代和第7代,分析同一龄期不同世代转录组的差异,结果发现,第1代西花蓟马2龄若虫上调基因有485条,下调基因有408条;西花蓟马雌成虫的上调基因和下调基因分别为78和440条。到第7代后,西花蓟马2龄若虫和雌成虫总获得531条差异基因,2龄若虫上调和下调基因分别有145和110条,而雌成虫上调和下调基因分别为69和207条。且这些差异基因主要富集在细胞组分和生物过程。将不同处理后获得的差异基因富集到GO数据库,这些差异基因中大部分参与了西花蓟马的代谢过程、细胞过程、细胞及细胞部分、催化活性和结合等生理过程。2.2、取食同一处理菜豆的西花蓟马转录组分析西花蓟马取食同一种处理寄主(健康菜豆或二斑叶螨诱导菜豆)并繁殖第1代和第7代,结果发现取食健康菜豆植株后,2龄若虫上调基因和下调基因分别获得1101和925条,而雌成虫仅有46条和371条。当取食二斑叶螨为害的菜豆植株后,西花蓟马2龄若虫的差异基因数明显增多,2龄若虫的上调基因和下调基因分别有8534和1698条,而雌成虫的差异基因仅有319和1377条。将西花蓟马取食同一处理菜豆不同世代的差异基因比对到GO数据库,注释结果发现大部分差异基因参与了西花蓟马的代谢过程、细胞过程、细胞及细胞部分、催化活性以及结合等生理过程。2.3、差异基因Pathyway通路分析将取食相同处理菜豆不同世代,以及取食不同处理菜豆同一世代的西花蓟马,进行差异基因Pathyway通路富集分析,结果发现获得的差异基因均主要富集在代谢和有机系统模块,其中大部分基因参与了昆虫的碳水化合物代谢、脂肪代谢、免疫系统和消化系统。西花蓟马取食二斑叶螨处理菜豆获得的差异基因数明显比取食健康菜豆的差异基因数多。说明西花蓟马在适应二斑叶螨取食诱导菜豆的过程中,激活了西花蓟马体内代谢、免疫系统和消化系统等等相关的应答反应,以适应不同诱导的菜豆抗性。3、差异基因的筛选根据GO和KEGG注释结果筛选获得西花蓟马在适应取食健康菜豆和二斑叶螨为害菜豆过程中消化酶、解毒酶和免疫系统的差异表达基因,其中消化酶系:如脂肪酶、丝氨酸蛋白酶、羧肽酶、胰蛋白酶和氨基肽酶等,分别获得240、99、88、85和78条;解毒酶:细胞色素P450s大家氧化酶系、酯酶类(羧酸酯酶)、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽S-转移酶,分别有291、131(27)、9和5条;在西花蓟马的免疫系统,有99、28、22、15和7条差异基因分别属于丝氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂、肽聚糖识别蛋白、清道夫受体和C型凝集素。说明二斑叶螨侵染后诱导激活了西花蓟马体内的消化代谢、解毒代谢和免疫系统相关基因的应答,其中脂肪酶、P450s和丝氨酸蛋白酶是此过程中主要应答基因。
【图文】：

流程图,转录组,信息分析,测序

（8） 13600 rpm，4℃离心 20 min。（9）吸弃上清，加入 1 mL75%乙醇，用移液器吹洗沉淀。（10） 10000rpm，4℃ 离心 3min，吸弃上清，短暂离心，吸去残留液体，晾干 3-5min。（11）用 30-100 μLDEPC 水或者 RNase-free 水溶解沉淀。提取 RAN 后用 2100 生物分析仪对各处理 RNA 进行质量检测，质量合格后用于转录组上机测序。1.3.3 转录组分析流程首先，，过滤掉低质量、接头污染以及未知碱基 N 含量过高的 reads，过滤后的数据称为clean reads。然后对 clean reads 进行组装得到 Unigene，之后对 Unigene 进行功能注释、SSR检测，对每个样品计算 Unigene 表达水平。最后，对于多个样品根据需求检测不同样品之间的差异表达基因，并对差异表达基因做深入的聚类分析和功能富集分析。

组装过程

图 2.2 组装过程Figure 2.2 The process of assembly1.3.7 Unigene 功能注释NT、NR、GO、KOG、KEGG、SwissProt 以及 InterPro 都属于功能性数据库。我们使用Blastn（Altschul et al., 1990）对 Unigene 进行 NT 注释，使用 Blastx（Altschul et al., 1990）或 Diamond（Buchfinketal.,2015）对 Unigene 进行 NR、KOG、KEGG 以及 SwissProt 注释，使用 Blast2GO（Conesa et al., 2005）以及 NR 注释结果进行 GO 注释，使用 InterProScan 5（Quevillon et al., 2005）进行 InterPro 注释。1.3.8 Unigene 表达量计算及差异基因分析使用 Bowtie 2（Langmead and Salzberg, 2012）将 clean reads 比对到 Unigene，然后使用RSEM（Li and Dewey, 2011）计算各个样品的基因表达水平。根据需求，我们使用 DEseq2方法进行差异基因检测。DEseq2 方法基于负二项分布原理，本项目根据 Love 等（2014）中描述的方法进行 DEG 检测，我们采用差异倍数在两倍及以上且校正的 P 值小于等于 0.05 来
【学位授予单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S436.43

【参考文献】