Tci-miR-1-3p靶向TCGSTM4调控朱砂叶螨丁氟螨酯抗药性研究

发布时间：2020-06-13 20:49

【摘要】：朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)是一种可危害多种农作物的重要农业害螨,由于叶螨的自身特点以及化学药剂的大量使用,其抗药性问题日趋严重。丁氟螨酯是一种新型的苯甲酰乙腈类杀螨剂,于2007年首先在日本登记。目前已在十五个国家广泛使用,而叶螨对丁氟螨酯产生抗药性已多有报道。MicroRNA(miRNA)作为调控基因表达的重要因子,在害虫的研究中发现其可通过调控抗药性基因的表达,进而影响害虫抗药性的形成。在昆虫中,miR-1是一个相对保守且表达丰度较高的miRNA,主要调控昆虫的生长发育及免疫应答过程,迄今尚未发现其调控害虫(螨)抗药性的报道。本论文鉴定了朱砂叶螨miR-1(Tci-miR-1-3p)调控的抗性相关靶标基因,明确靶标基因在朱砂叶螨丁氟螨酯抗性形成中的功能,进而阐明了Tci-miR-1-3p在朱砂叶螨丁氟螨酯抗性形成中的作用,主要研究结果如下:1.Tci-miR-1-3p在敏感、抗性品系中差异表达分析采用实时荧光定量PCR技术检测Tci-miR-1-3p在丁氟螨酯敏感品系(SS)和抗性品系(CYR)中表达量,发现Tci-miR-1-3p在CYR中的表达量较SS显著降低,暗示其与朱砂叶螨丁氟螨酯抗性的形成有关。2.Tci-miR-1-3p靶标基因的筛选及验证为了明确Tci-miR-1-3p调控抗药性的深层机制,采用miRanda和RNAhybrid等六种miRNA靶标预测软件筛选Tci-miR-1-3p的靶标基因,共获得谷胱甘肽S-转移酶(TCGSTM4)、EF-hand蛋白(EFHAND2)、细胞色素P450(CYP307A1)和羧酸酯酶(TCCarE 14)等19条候选基因。进一步采用饲喂法验证Tci-miR-1-3p与候选基因的靶向关系,结果表明,取食Tci-miR-1-3p模拟物(Tci-miR-1-3p mimic)后,朱砂叶螨体内Tci-miR-1-3p的含量较对照显著增加,同时候选靶标基因中仅TCGSTM4和EFHAND2分别降低至0.57和0.55倍,由此表明候选靶标基因中TCGSTM4和EFHAND2可能受到Tci-miR-1-3p的反向调控。综合有关基因功能的文献报道,选择与螨类抗药性关系更密切的TCGSTM4作为靶标基因进行下一步的靶向关系研究。双荧光素酶报告系统进一步明确了Tci-miR-1-3p与TCGSTM4的靶向关系:当Tci-miR-1-3p模拟物与TCGSTM4的3’非编码区(3’UTR)双荧光素酶报告基因载体(pmirGLO-UTR)转染人肾上皮细胞系(HEK293T)细胞后,荧光活性显著降为对照组(阴性对照模拟物与pmirGLO-UTR共转染HEK293T细胞)的50%;而将Tci-miR-1-3p模拟物与突变的3’UTR双荧光素酶报告基因载体(pmirGLO-MUTR)转染HEK293T细胞后,荧光活性则和对照组没有显著差异。以上结果说明Tci-miR-1-3p能够与TCGSTM4相应的非编码区结合而调控TCGSTM4的表达,也就是说Tci-miR-1-3p对TCGSTM4存在靶向调控关系。3.Tci-miR-1-3p对TCGSTM4的表达以及对朱砂叶螨药剂敏感性的影响分别饲喂Tci-miR-1-3p模拟物和抑制剂(Tci-miR-1-3p inhibitor)来提高和降低朱砂叶螨体内Tci-miR-1-3p的含量,然后检测TCGSTM4表达量随Tci-miR-1-3p含量改变而变化的情况以及朱砂叶螨对丁氟螨酯敏感性的变化。饲喂模拟物后,Tci-miR-1-3p在SS和CYR体内分别上调1.51和2.93倍,TCGSTM4表达水平相应降低至0.57和0.72倍,TCGSTM4蛋白表达水平也分别降低至0.47和0.61倍。相反,饲喂抑制剂后,Tci-miR-1-3p在SS和CYR体内分别降低至0.69和0.52倍,TCGSTM4表达水平相应显著上调1.29和1.32倍,TCGSTM4蛋白表达水平也分别上调1.96和2.11倍。此外,朱砂叶螨敏感及抗性品系在饲喂Tci-miR-1-3p模拟物后,丁氟螨酯LC_(10)和LC_(30)浓度下的死亡率显著升高,其中敏感品系升高了14.01%和14.86%,抗性品系升高了16.69%和20.07%;而在饲喂Tci-miR-1-3p抑制剂后,LC_(30)和LC_(50)浓度下的死亡率均显著降低,其中敏感品系降低了12.12%和12.15%,抗性品系降低了14.37%和24.13%。通过饲喂模拟物和抑制剂,人为提高和降低朱砂叶螨体内Tci-miR-1-3p含量的方式进一步证实Tci-miR-1-3p能够反向调控TCGSTM4的表达,进而影响到朱砂叶螨对丁氟螨酯的敏感性。4.TCGSTM4的RNA干扰及其响应药剂胁迫研究为了明确TCGSTM4是否参与了朱砂叶螨丁氟螨酯抗药性的形成,本研究通过RNA干扰(RNAi)技术对TCGSTM4进行功能研究。结果显示:饲喂TCGSTM4 dsRNA后,TCGSTM4的表达在SS和CYR中分别降低至0.41倍和0.49倍。与对照组相比,SS和CYR在饲喂TCGSTM4 dsRNA 48 h后,使用LC_(10)和LC_(30)浓度处理后的死亡率均显著升高,其中敏感品系升高了11.69%和15.69%,抗性品系升高了16.72%和19.19%。另外,经丁氟螨酯亚致死剂量(LC_(10))诱导后,TCGSTM4表达量在CYR中显著上调(诱导12h和24h后),而敏感品系诱导前后TCGSTM4的表达量没有显著变化。RNAi和药剂胁迫实验结果表明TCGSTM4在丁氟螨酯的抗性形成中具有重要作用。5.TCGSTM4的原核表达及其药剂代谢研究借助E.coli系统,将朱砂叶螨TCGSTM4进行基因异源表达,获得了26 kDa大小的可溶蛋白。利用谷胱甘肽S-转移酶特异底物1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)对纯化的重组蛋白进行活性测定,发现其具有CDNB催化活性(比活力值为428.90±12.98 nmol/mg pro.min~(-1))。同时该蛋白的催化活性可被丁氟螨酯和丁氟螨酯在螨体内的活化物质(AB-1)所抑制,抑制中浓度值分别为0.83±0.08 mM和0.18±0.05 mM。进一步的药剂代谢实验结果发现TCGSTM4重组蛋白能够直接降解丁氟螨酯,并且随着重组蛋白用量增加,丁氟螨酯的降解率也逐渐升高:当TCGSTM4重组蛋白添加量为20.0μg、40.0μg和60.0μg时,丁氟螨酯的降解率分别为32.21%±2.44%,36.00%±5.83%和41.79%±1.69%。基因异源表达及其与杀螨剂互作的研究结果证明TCGSTM4的编码产物是GST酶蛋白,且能够有效分解丁氟螨酯。
【图文】：

图 1.1 miRNA 的形成过程自 http://www.bio1000.com/zt/experiment/molecular/503841.html）Fig 1.1 The formation process of miRNAted from http://www.bio1000.com/zt/experiment/molecular/503841.htm是一类转录后水平的调控因子，它主要作用于目的基因转调节目的基因的表达。MiRNA 作用的方式一般有两种：一种式导致翻译的抑制，另一种是以完全或近乎完全互补的被降解[53]。MiRNA 与目标 mRNA 的结合位点一般位于目标 研究发现在目标 mRNA 的开放阅读框和 5’UTR 也存在 miR。互补结合位点位于 3’UTR 的概率要比位于开放阅读框的概的概率又要比位于 5’UTR 的概率大。，大多数 miRNA 通过和目标 mRNA 完全配对从而降解 m般 miRNA 是通过抑制目的 mRNA 的翻译来达到调控作用[56明动物的 miRNA 能够通过降解 mRNA 来降低 mRNA 的

第二章 Tci-miR-1-3p 的差异表达检测及抗性相关靶标筛选）挑取 3-5 日龄雌成螨置于 2.0 mL 的离心管中，进行饥饿处理 2）将豇豆叶片剪成边长为 1.5cm 大小，，然后置于 60 ℃烘干 3-5mRNAmimic 溶液中（10mM）3-5h，待试剂被充分吸收，以 DEPC照，另设 Negative mimic 作为阴性对照（图 2.1）；）挑取饥饿处理 24 h 的雌成螨在豇豆叶片上，取食 48 h；）最后挑取饲喂 48 h 后的雌成螨进行接下来的试验。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S433.7

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本文编号：2711725